реал тайм Эльдар


Чтобы посмотреть презентацию с картинками, оформлением и слайдами, скачайте ее файл и откройте в PowerPoint на своем компьютере.
Текстовое содержимое слайдов презентации:

ПЦР в реальном времени В 1971 г был описан искусственный синтез ДНК с использованием праймеров. (Kleppe et al.)В 1983 г. Kary Mullis предложил метод, обеспечивающий накопление (амплификацию) синтезируемого фрагмента ДНК, (с использованием DNA Pol I E.coli и термостата) получивший название полимеразная цепная реакция (Нобелевская премия по химии 1993 г).В 1980 г. Городецкий и др. выделил TaqPol из T. aquaticusВ 1986 предложена ПЦР с использованием TaqPol (David Gelfand at all, 1988) Области применения ПЦР: ПЦР Получение материи Получение информации анализ уровня представленности транскриптов in situ ПЦР ДНК-диагностика в медицине генотипирование - клонирование ДНК- вычитающая гибридизация- дифференциальный дисплей (+ Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)- in vitro мутагенез Структура и свойства Taq-ДНК-полимеразы Наличие 5’→3’ экзонуклеазной активности Отсутствие 3’ →5’ экзонуклеазной активности Высокая термостабильнсть (время полужизни: ~ 2 часа при 95ОС) Скорость синтеза ДНК ~ 50 нт/сек при 72ОС Nuclease domain KlenTaq Oligonucleotide Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл Затем весь цикл повторяется 30-40 раз чего, как правило, бывает достаточно, чтобы увидеть продукт реакции в агарозном геле, прокрашенном бромистым этидием. Бромистый этидий светится при возбуждении ультрафиолетом только если связан с двуцепочечной нуклеиновой кислотой. Анализируя ПЦР продукт таким методом, трудно измерить точное его количество. Однако, сравнительно недавно, был предложен другой способ измерения количества продукта ПЦР, получивший название “ПЦР в реальном времени”, так как позволяет прямо во время амплификации наблюдать увеличение количества ПЦР продукта. Варианты «информационной» ПЦР Качественная(скрининг, идентификация)ответ: ДА / НЕТ Количественнаяответ: сколько 1 2 3 4 5 Но, конечно, реакция не может происходить вечно, в конечном счете она выйдет на стадию насыщения или плато... показано красным... конкуренция между отжигом праймеров и ренатурацией продукта ПЦРконкуренция за реактанты неспецифическими продуктами ПЦР или димерами праймеровистощение субстратов (dNTP и праймеров)падение активности реактантов (dNTP и Taq-pol)накопление пирофосфатов Основные причины выхода на «плато» 14 17 20 24 26 cycles Основные компоненты ПЦР Реакционная смесь:ДНК матрицаПраймер(ы)Смесь dNTPsMg2+-содержащий буферТермостабильная ДНК полимеразаВода Температурный режим:Денатурация (95ОС – 5-30 сек)Отжиг праймера (Т отжига – 2-20 сек)Элонгация (72ОС – 1-3 мин) Количество циклов завсист от кол-ва матрицы и кол-ва продукта, которое необходимо получить Температура отжига:Т отжига = Tm + 5Tm= 2(A+T) + 4(G+C) Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов) a – начальная денатурация ДНКb – собственно реакцияс – достройка цепей ДНК Варианты «проявки» ДНК Негибридизационные Гибридизационные Флуоресцентные интеркаляторы:EtBr, SYBRgreenIэлектрофорезметод "кривых плавления Меченые праймеры Зонды Метод количественной ПЦР основан на том, что увеличение флуоресценции ДНК по мере ее накопления измеряется непосредственно в пробирке во время амплификации. На сегодняшний день существует три способа визуализации продуктов ПЦР: Использование SYBR green (больший квантовый выход по сравнению с бромистым этидием) TaqMan пробы “Молекулярный бекон” Таким образом работает Sybr Green и другие интеркалирующие краски: Плюсы этого метода: низкая стоимость реакции можно наблюдать за продуктами амплификации по кривым плавления Sybr Green связывается с любой двуцепочечной ДНК, необходимо четко следить за продуктами амплификации при помощи кривых плавления или гельэлектрофореза. Однако: Tagman проба состоит из олигонуклеотида, комплементарного интересующей нас мишени, и двух типов ковалентно пришитых к нему флюорофоров: reporter (репортера) и quencher (тушителя). Во время реакции проба облучается длиной волны, возбуждающей репортер. Пока проба сохраняет свою целостность, флюорофор – тушитель уменьшает флюоресценцию репортера по механизму флюоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). После того, как полимераза доходит до праймера и расщепляет его, репортер высвобождается, изменяется расстояние между ним и тушителем, и репортер начинает светиться. Разгорание зонда Плюсы этого подхода: увеличивается специфичность реакции (только специфичная гибридизация дает флюоресцентный сигнал) можно проводить реакцию с несколькими праймерами в одной пробирке (мультиплексирование) Но , по сравнению с Sybr Green, реакция получается дороже.... Молекулярным беконом называют одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий шпилечную структуру и ковалентно пришитые флуорофор и тушитель. В присутствие мишени, его структура разворачивается, он связывается с мишенью и начинает флюоресцировать. Данная проба состоит из 4 частей: петля : это регион состоящий из 18-30 оснований, которые комплементарны последовательности гена – мишени. стержня: последовательности стержня - 5-7 bp в начале и в конце пробы, комплементарные друг другу. 5' флюорофор: краска, которая светит при разворачивании пробы в присутствии последовательности – мишени. 3' тушитель (не флюоресцентный При проведении количественной ПЦР молекулярный бекон связывается с амплифицированной мишенью на каждом цикле амплификации. Флюоресценцию наблюдают каждый раз во время отжига праймеров, когда бекон связывается со своей мишенью. Данный механизм используется в количественной ПЦР или в реакции обратной транскрипции, для того, чтобы определить количество исходных копий. Структура молекулярного бекона делает его более специфичным для распознавания однобуквенных мисматчей (по сравнению с линейной пробой), так как шпилька делает гибриды с мисматчем термодинамически менее стабильными по сравнению с подобными гибридами для линейных проб. Для измерения флуоресценции ПЦР продуктов были разработаны специальные приборы. Теперь рассмотрим как происходит определение количества ДНК в Реал Тайм ПЦР. Теоретически, количество ДНК удваивается в каждом цикле ПЦР. Таким образом, после двух циклов мы имеем в 2 X 2 раза больше, после 3 циклов –в 2 X 2 X 2 раз больше или в 8 раз, после 4 циклов - в 2 X 2 X 2 X 2 раза больше или в 16 раз. Таким образом, после N циклов мы получим продукта в 2N раз больше, чем было до начала реакции.   Как же происходит измерение концентрации DNA или cDNA? Здесь, те же самые кривые, представлены в логарифмической шкале… Каждая кривая на рисунке пересекает пороговую линию…Точки пересечения кривых с этой линией называют пороговыми циклами и обозначают Ct. Таким образом более разведенные образцы имеют большее значение Ct. Важно, чтобы пороговая линия проходила в линейной части кривой амплификации. Это проще сделать в логарифмическом виде. Тем не менее, пороговая линия должна быть достаточно высоко, чтобы быть уверенным что флюоресценция реакции отличается от фона. Здесь представлена пороговая линия в обычных и логарифмических координатах… Если мы построим график зависимости Ct от концентрации ДНК – мы получим линейную зависимость с хорошим коэффициентом корреляции (как правило более 0.990).  Определение количества mRNA Метод стандартных кривых Разберем пример дизайна эксперимента для метода стандартных кривых. При использовании метода стандартных кривых следует соблюдать следующие требования:• Стандартная DNA или RNA должна быть чистой, без примесей. Для примера, плазмидная ДНК, выделенная из E. coli как правило загрязнена RNA, которая увеличивает показатель A260 и искажает количество копий плазмиды в стандарте.• Тщательно готовить растворы стандартов (как правило для сопоставления концентраций стандартов с концентрациями образцов, стандарты требуется сильно разводить...). • Тщательно контролировать стабильность приготовленных стандартов, особенно РНК • Ну и конечно, нельзя использовать DNA в качестве стандарта для определения количества РНК, так как в этом случае исчезает контроль на эффективность реакции обратной транскрипции. Рассмотрим схему эксперимента для определения количества гена RNase P в двух популяциях. Так как исследуется один ген, требуется одна калибровочная кривая. Для того, чтобы данные были достоверными, каждая точка повторена четырежды. Далее по калибровочной кривой машина посчитает концентрациюДНК (РНК) в неизвестных образцах. Рассмотрим серию вычислений, показывающих насколько количество амплифицированной ДНК зависит от эффективности реакции. При 100% эффективности за 1 цикл количество ДНК должно удваиваться, при 90% эффективности количество ДНК возрастет от 1 до 1.9 в каждом цикле, и таким же образом при эффективности в 80% и в 70% - в 1.8 и 1.7. На этом слайде представлено как влияет эффективность реакции на значение Ct (которое нас и интересует). Следует отметить , что изменение эффективности так же влияет на наклон кривой в логарифмической шкале. Отсюда видно, что чем выше цикл, тем больше различия в кривых связанные с эффективностью... Таким образом, чем ниже пороговая линия, тем меньше ошибка, связанная с разной эффективностью реакций... Обратимся к тому, как происходит сравнение количества мРНК в Нозерн блотиннге Далее, применим данный подход в эксперименте с использованием методаколичественной ПЦР... Теперь рассмотрим изменения уровня экспресии RPLP0. Так как значения Ct очень близки и их отношение близко к 1, авторы полагают, что RPLP0 хороший эндогенный контроль для данного эксперимента. Таким образом рассмотренный метод требует определения эффективности Ваших праймеров... (87% для RPLP0 primers). Следовательно мы можем посчитать AFTER N CYCLES: increase = (efficiency)n AFTER N CYCLES: increase = (1.87)(19.93-19.80) = (1.87)0.13  = 1.08 fold increase this is the formula in Pfaffl paper. Delta-Delta CT Метод  (метод аппроксимаций)Этот метод был одним из первых. Однако, как мы увидим далее , в нем много приближений и для того, чтобы доказать, что они правильные требуется, по мнению авторов, больше усилий, чем при использовании метода Pfaffl. Приблизительную коррекцию можно сделатьследующим образом : посчитать разницу между значением Ct для IL1-beta и значением Ct для RPLP0 для контрольного образца, и затем для обработанного образца (зеленые стрелки). Посмотрим на не же данные, которые обсуждались выше... Разница между контрольными и обработанными клетками для interleukin 1-beta показана красным цветом. Если мы знаем эффективность реакции для IL-1 beta и номер цикла, мы можем вычислить изменение для IL-1 beta. Разница между двумязначениями delta Ct (delta delta Ct), представляет скорректированный сдвиг для IL1-beta. В этом случае, кривая для IL1-beta в эксперпементальном образце сдвинут влево от стандарта, поэтому delta Ct будет иметь отрицательное значение . Вматематике отнять отрицательное значение, все равно, что прибавить его модуль – это разумно отражено на диаграмме. Общий сдвиг эквивалентен сумме двух зеленых стрелок. Посмотрим насколько будут отличаться результаты рассчитанные по методу Пфаффла и по методу дельта-дельта Ct. В данном случае результаты окажутся близки. ПРиближение этого метода состоит в том, что эффективность реакции для RPLP0 близка к эффективности для IL1-beta , или что разница в значениях Ct для генов эндогенного контроля не велика (при расчете выше она составила 1.08 раз). Проблема с этим методом в том, что если вы разводите образец, то разница в значениях Ct между геном-мишенью и геном – эндогенным контролем должна оставаться одинаковая. Однако, как видно из этого рисунка, когда мы делаем серию из 10-кратного разведений delta Ct (разница между фиолетовой и красной линиями) не остается постоянной – даже если разница в эффективности реакции для данных праймеров составляет всего 10%. Тем не менее, если у праймеров одинаковая эффективность, то этот метод работает хорошо. Схема эксперимента с использованием метода дельта дельта Сt Дизайн эксперимента с использованием метода дельта дельта Сt Для того, чтобы использовать данный методнеобходимы соответствующие внутренние стандарты (эндогенный контроль). К этим стандартам принято предъявлять следующие требования: ген, который используется в качестве внутреннего стандарта, должен иметь одинаковое количество копий во всех клетках Экспрессируется во всех клетках уровень его экспрессии не должно быть очень высоким или очень низкимВ действительности подобных стандартов не существует... Тем не менее , какой бы ген вы решились использовать в качестве внутреннего стандарта, он должен быть валидирован для вашей ткани...И если возможно, вы должны показать что с его экспрессией не происходит значительных изменений в течение Вашего эксперимента. Общепринятыми стандартами считаются: GAPDH mRNABeta actin mRNAMHC I (major histocompatibility complex I) mRNACyclophilin mRNAm RNAs for certain ribosomal proteins e.g. RPLP0 (ribosomal protein, large, P0). This is also known as 36B4, P0, L10E, RPPO, PRLP0, 60S acidic ribosomal protein P0, ribosomal protein L10, Arbp or acidic ribosomal phosphoprotein P0.28S or 18S rRNAs (ribosomal RNAs) Машины для ПЦР в реальном времени не только регистрируют количество образовавшейся ДНК, но также могут регистрировать температуру плавления продуктов в конце амплификации. Эта температура зависит от GC состава ампликонов и длины ампликонов. (особенно если они короткие). При использовании Sybr Green необходимо контролировать что конкретно у Вас амплифицируется. Это можно сделать исследуя кривые плавления. В идеале, все продукты ПЦР должны иметь одинаковую температуру плавления. Если это не так, можно предположить следующие причины : загрязнение, артефакты связанные с димеризацией праймеров… 1 Праймеры связываются к комплементарной или частично комплементарной последовательности на ДНК, которая не является мишенью2 Артефакты связанные с димеризацией праймеров… красным показана кривая , где отсутствует матрица…  Данное сообщение подготовлено на материалах (экспериментальных и теоретических) представленных и компанией Applied Biosystem в сети Internet.

Приложенные файлы

  • ppt 11401355
    Размер файла: 6 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий