Культивирование МО

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием, а развившиеся на таких средах микроорганизмы культурой. При культивировании происходит рост культуры физиологический процесс, в результате которого увеличивается биомасса (масса клеточного вещества данного микроорганизма).
Для культивирования микроорганизмов применяются питательные среды, которые не только должны содержать все питательные вещества, необходимые для конструктивного и энергетического обменов, но и являться средой обитания. Поэтому в ней должны поддерживаться определенные оптимальные для каждого вида микроорганизма физико-химические условия (температура, аэрация, кислотность среды и пр.), в которых обмен веществ между клетками микроорганизмов и средой осуществляется наиболее интенсивно.

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
По составу питательные среды принято делить на естественные (или натуральные) и синтетические.
Натуральными (естественными) обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. Основой таких сред являются овощные и фруктовые соки, молоко, животные ткани (мясо, рыба, печень и др.), разведенная кровь, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, таких как мясо, солод, картофель, почва, дрожжи и др. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку они содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов и накопления биомассы. Однако эти среды имеют сложный, неопределенный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов.
К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный бульон (МПБ), неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельные среды, почвенный экстракт.
Синтетическими называют среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.
В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным натуральным средам.
Полусинтетические среды также относятся к средам неопределенного состава. Их главными составными частями являются известные соединения (углеводы, соли аммония, нитраты, фосфаты и т. д.), а компонент неопределенного состава (кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, гидролизат казеина и др.) содержится в относительно низких концентрациях. Такие среды находят особенно широкое применение в биотехнологии аминокислот, витаминов, антибиотиков и др.
По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические среды.
Элективные среды предназначены для выделения чистых культур микроорганизмов из среды их естественного обитания (воды, почвы, пищевых продуктов и т. п.).
Дифференциально-диагностические среды это такие среды, с помощью которых можно довольно быстро отличить (дифференцировать) одни виды микроорганизмов от других. Их состав подбирается с таким расчетом, чтобы можно было четко выявить наиболее характерные свойства данного вида. Примером такой среды для выявления кишечной палочки в естественных субстратах (воде, пищевых продуктах) может служить среда Эндо. Кишечная палочка образует на этой среде малиновые колонии с металлическим блеском. Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрого ориентировочного определения отдельных групп микроорганизмов.
Питательные среды бывают жидкие, плотные и сыпучие. Основой жидких сред является вода. К ним относятся отвары и экстракты (натуральные среды) или растворы химических веществ и других компонентов (синтетические и полусинтетические среды).
Плотные среды получаются путем прибавления к жидким средам желатина или агар-агара (вещество, добываемое из морских водорослей, содержит главным образом полисахариды). Недостатком желатина является низкая температура плавления (2427 °С), а агар-агар плавится при 100 °С и застывает при 4045 °С. При развитии в жидкой среде культуры микроорганизмов образуют суспензии, осадок или пленку, ори развитии на плотной среде колонии.
Агаризованные питательные среды находят чрезвычайно широкое применение в микробиологической практике. Они используются: для изучения характера роста и классификации микроорганизмов; для количественного учета микроорганизмов; для выделения чистых культур микроорганизмов при микробиологическом анализе воздуха, воды, почвы и т. д.; для пересылки культур микроорганизмов на расстояние, например культура дрожжей на заводы высылается на сусловом агаре; для длительного хранения культур. Плотные питательные среды обладают еще тем преимуществом, что загрязнение культур извне на жидкой среде в большинстве случаев бывает незаметно, а на плотной это сразу заметно, так как инородная культура развивается в самостоятельную, хорошо отличимую невооруженным глазом колонию.
Сыпучие среды, например отруби, применяют для культивирования некоторых микроорганизмов в производстве биологически активных веществ; (ферментных препаратов).
Рецептура основных питательных сред приводится в руководствах к лабораторным занятиям.



ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ПОЛУЧЕНИЕ
В естественных условиях обитания микроорганизмы встречаются не изолированными культурами определенного рода и вида, а образуют сообщества биоценозы. Изучение морфологических и физиологических свойств того или иного вида микроорганизмов возможно лишь при условии полной изоляции его от других видов. Для этой цели проводят выделение микроорганизмов в чистую культуру.
Чистой культурой микроорганизмов называют культуру которая представлена потомством одной клетки. Естественным путем получить чистую культуру почти невозможно, поэтому ее получают искусственно. В некоторых случаях выделение производится путем изолирования одной клетки микроорганизма одним из специальных приемов, затем осуществляют ее размножение на подобранной для данного микроорганизма питательной среде.
Чаще перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (почвы, воды), в котором данный микроорганизм находится в небольшом количестве, получают накопительные культуры в элективных условиях.
Внесение клеток микроорганизма или исследуемого материала, содержащего микроорганизмы (образца почвы, пробы воды, пищевого продукта), в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называется посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называется пересевом. Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток одного вида микроорганизма. Элективные (или избирательные) условия это условия, способствующие развитию одной выделяемой культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов. Элективные условия можно создать путем использования элективных сред. Например, элективная среда для уксуснокислых бактерий состоит из пива с добавлением 24% этилового спирта.
Накопительные культуры автотрофных организмов получают на средах, где единственным источником углерода является диоксид углерода; отсутствие в среде органических соединений углерода задерживает развитие гетеротрофов. Кроме использования элективных сред элективными условиями могут быть, например, повышенная температура для термоустойчивых форм, повышенная кислотность для кислотоустойчивых и т. д. В элективных условиях происходит преимущественное накопление в микробном комплексе выделяемой культуры, а сопутствующие микроорганизмы совсем не будут развиваться.
После получения накопительной культуры приступают к выделению чистой культуры. Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов до настоящего времени является метод, предложенный Кохом. Для этого делается посев разбавленной суспензии клеток накопительной культуры на плотную среду с целью получения из каждой клетки отдельной колонии. Колония состоит обычно из клеток, развившихся от одной клетки, и является чистой культурой.
Обычно микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах специальных шкафах или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью особых терморегуляторов.
Культивирование при определенной температуре называется инкубацией, или инкубированием.
Чистые культуры чаще всего сохраняют в пробирках на плотной среде. При этом требуется постоянно делать пересевы на свежую питательную среду. Другими способами хранения чистых культур микроорганизмов являются сохранение их на питательной среде под слоем вазелинового масла или в лиофи-лизованном состоянии. Лиофилизированные культуры получают путем особой лиофильной сушки под вакуумом замороженных клеток микроорганизмов.
В пищевой промышленности применяют чистые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых бактерий и др., обладающих ценными для производства свойствами, что гарантирует получение стандартной продукции высокого качества. В последнее время находят успешное применение двухкомпо-нентные чистые культуры, состоящие из двух видов микроорганизмов.
Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Там они выделяются из различных субстратов, изучаются, а наиболее продуктивные, пригодные для производства хранятся в коллекции музея чистых культур. Чистые культуры рассылаются научно-исследовательскими отраслевыми институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность. Разведение чистой культуры осуществляется путем посева микроорганизмов из коллекционной культуры в стерильную питательную среду и включает несколько последовательных пересевов в постепенно возрастающие объемы питательной среды.
Процесс разведения состоит из двух стадий: лабораторной (разведение культуры в микробиологической лаборатории) и производственной (разведение в отделении чистой культуры). После производственного разведения получают технически чистые культуры в количестве, достаточном для засева производственных емкостей. В разных производствах технически чистые культуры называют по-разному: семенные, засевные, маточные культуры и т. д. Для каждого производства разработаны свои схемы разведения чистой культуры.
При работе с чистыми культурами необходимо соблюдать стерильность, то есть исключить попадание и развитие посторонних микроорганизмов. Имеются различные методы стерилизации.

СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Культивирование можно проводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Здесь рассматриваются в основном методы, используемые в технологии пищевых и микробиологических производств с использованием только аэробных микроорганизмов.
Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования: либо целью является накопление биомассы, либо получение определенного продукта жизнедеятельности микроорганизма (метаболита).
Поверхностный метод. Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. В связи с этим при поверхностном культивировании стараются увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок (например, в производстве лимонной кислоты). На сыпучих питательных средах поверхностным методом получают ферментные препараты.
Глубинный метод. Этот метод культивирования осуществляется на жидких средах, в которых микроорганизмы развиваются во всей толще. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Так как микроорганизмы могут утилизировать только растворенный в воде кислород, а растворимость кислорода в воде невелика, то для обеспечения роста аэробных микроорганизмов их необходимо постоянно снабжать кислородом. Процесс подвода кислорода в глубь жидкой среды называется аэрированием. Аэрирование осуществляется путем продувания стерильного воздуха через культуральную жидкость.
Глубинный способ широко используется для получения биомассы микроорганизмов (прессованные хлебопекарные дрожжи, кормовые дрожжи) и различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (органических кислот, ферментов, антибиотиков, аминокислот).




Глубинное культивирование продуцентов этих веществ в производстве осуществляют в специальных аппаратах ферментаторах (рис. 1), объем которых может достигать 100 м3 (100 000 л). В современных конструкциях ферментаторов количество пропускаемого воздуха поддерживается автоматически. Воздух стерилизуется при прохождении через активированный древесный уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком, или специальные полимерные фильтрующие материалы. Для более сильного распыления и дробления пузырьков воздуха его пропускают через пластинки с мелкими отверстиями барботеры, которые помещают непосредственно в ферментаторы. Принудительную аэрацию в ферментаторах обычно совмещают с перемешиванием среды с помощью мешалок, вращающихся с частотой от десятков до тысяч оборотов в минуту. Это обеспечивает максимальный контакт клеток с кислородом воздуха, с питательными веществами, резко увеличивается поверхность соприкосновения клеток и позволяет поддерживать максимальную скорость образования вывода и метаболитов из клеток.
Преимущества глубинного культивирования заключаются в том, что этот способ не требует больших площадей и громоздкого оборудования, объем ферментаторов можно увеличить за счет увеличения высоты. Преимуществами являются также простота обслуживания, возможность автоматизации, а главное, удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости.
Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом методе культивирования весь объем питательной среды засевают чистой культурой и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Поскольку культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях. Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и отравление вредными продуктами обмена. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства (рис. 2).

Фазы роста и развития микроорганизмов
Первая стадия лаг-фаза или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, происходит повышение содержания нуклеиновых кислот, увеличение размера. Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т. е. ее росту и размножению.


















Рис 22 Кривая роста бактериальной культуры: I-лаг-фаза; II-логарифмическая фаза; III стационарная фаза; IV-фаза отмирания


Вторая стадия фаза логарифмического роста (экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 2030 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т. д.).
Третья стадия стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.
Четвертая стадия фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания ш автолиза (самопереваривания).
Периодическое культивирование осуществляется во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Недостатком периодического культивирования являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности фаза логарифмического роста занимает небольшую часть производственного цикла.
В течение последних тридцати лет все большее значение приобретает метод непрерывного культивирования микроорганизмов, который состоит в том, что культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает свежая питательная среда и с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Посевной материал выращивается до стадии логарифмического роста и вносится в питательную среду. Длительность периода логарифмического роста зависит от количества питательных веществ в среде, а также от количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой.
При большой скорости притока среда быстро обновляется питательные вещества не успевают исчерпаться, продукты обмена не успевают накопиться и культура поддерживается сколь угодно долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания. Несмотря на значительное аппаратурное усложнение технологического процесса, метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом.
В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.
Непрерывное культивирование очень перспективно и широко используется в пищевой и микробиологической промышленности и создает возможность автоматического поддержания заданных оптимальных условий, благодаря чему обеспечивается стандартность готового продукта при наименьших затратах.










13PAGE 15


13PAGE 14615


13 PAGE \* MERGEFORMAT 14615



Рис.-1; Схема ферментатора для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов: 1 вход воздуха; 2 выход воздуха; 3 барботер; 4 отбойник; 5 Мешалка




15

Приложенные файлы

  • doc 14697247
    Размер файла: 74 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий