5уМУэ глубинное культивирование

ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ





МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по учебной практике
студентов 4 курса обучения
по специальности 012400 «Микробиология»
специализация 012405 «Биотехнология»

Экспериментальное производство колибактерина


Глубинное культивирование

























Киров 2005

Составители:
к.б.н., Лауреат Государственной премии РФ Г.В. Комоско;
д.т.н. А.А. Лещенко

В подготовке материалов принимали участие:
н.с. Н.Г. Хапаев;
м.н.с. О.А. Чигринова

Рецензенты:
к.м.н., с.н.с., Лауреат премии Правительства РФ А.Н. Шевцов, начальник научного отдела НИИ микробиологии МО РФ;
к.т.н., с.н.с. С.С. Анкер, руководитель лаборатории госконтроля качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ О КОЛИБАКТЕРИНЕ

Колибактерин сухой представляет собой пористую массу без посторонних включений, стабилизированный в среде высушивания. Штамм E. Coli М – 17 обладает антагонистической активностью в отношении щигелл и ряда других патогенных и условно патогенных микроорганизмов кишечной группы. Антагонистическую активность штамма М – 17 оценивают в смешанных культурах по отношению к двум штаммам шигелл Флекснера и одному – двум штаммам шигелл Зонне. Антагонистический показатель к тест – штаммам шигелл Флекснера должен быть не ниже 60, а по отношению к тест – штаммам Зонне – не ниже 3.

СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Стерилизация – полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры).
В настоящее время в микробиологических производствах используется три способа стерилизации жидких питательных сред (физический, тепловой и химический). Одним из распространенных методов является метод тепловой (при помощи пара) стерилизации ПС. Он включает два способа стерилизации: непрерывный и периодический.
Непрерывный способ стерилизации заключается в бесперебойной подаче питательной среды в «зону» стерилизации. Он осуществляется при более высоких температурах и меньшем времени. Так, существуют установки для непрерывной стерилизации питательных сред. Они состоят из приемной емкости, выдерживателя, теплообменника. На стерилизацию ПС подается насосом в выдерживатель, в котором происходит инактивация микрофлоры. Затем ПС поступает в теплообменник, где за короткий промежуток времени охлаждается до 40єС. Время, затрачиваемое на стерилизацию 0,08 м3, равняется 11мин., температура стерилизации составляет 142144єС. При таком способе стерилизации сохраняются все необходимые компоненты питательной среды и, в то же время, инактивируется вся микрофлора.
Наиболее распространенным способом стерилизации ПС является периодический. Стерилизация ПС происходит в ограниченном пространстве (ферментер, автоклав). Данный способ занимает более продолжительное время и протекает при более низких температурах. Это основной способ стерилизации на большинстве микробиологических предприятияй. Заключается он в стерилизации ПС порционно, в зависимости от вместимости ферментера или автоклава и потребностей производства в стерильных питательных средах. При стерилизации основное значение имеют два фактора – температура и длительность ее воздействия. Чем выше температура, тем меньше время, необходимое для гибели микробов. Продолжительность воздействия, необходимая для уничтожения микробов при данной температуре, называется смертельным временем (Тс). Зависимость между смертельным временем и температурой приведена на рис. 1.


Рисунок 1 – Зависимость смертельного времени от температуры

Уравнение кривой, изображенной на рис. 1 принимает вид:

Tc=a-bt, (1)

Этот график имеет большое практическое значение, т.к. с его помощью можно рассчитать смертельное время для любой температуры. Коэффициенты a и b зависят от устойчивости данного микроба к тепловым воздействиям и физико-химических свойств среды, в которой они находятся. Кроме того коэффициент a зависит от начальной концентрации микробов Xо .
Многими исследователями было показано, что скорость разрушения вегетативных и споровых форм микробов прямо пропорциональна количеству выживших микробов:

X=Xо·е-Кт · t , (2)

где: X- концентрация микробов;
t- время;
Кт- константа термической гибели микробов;
Xо- начальная концентрация микробов.

Экспериментально установлено, что константа термической гибели зависит от температуры, физико-химических свойств среды, возраста популяции и так же, как константа химических реакций, подчиняется уравнению:

Кт= Аe-Е/RТ , (3)

где: А- множитель, мин –1 ;
Е- энергия активации, Дж/моль;
R- универсальная газовая постоянная, 8,314 Дж/(моль·K);
Т- температура стерилизации, К.

Температурные и временные режимы стерилизации ферментеров и автоклавов различны. Для ферментеров температура стерилизации составляет 125127єС и время – 4550 мин., для автоклавов – температура 121123єС и время 2030 мин.
Основные выводы, которые вытекают из процесса тепловой стерилизации ПС, сводятся к следующему. Для повышения эффективности тепловой обработки в целях обеспечения асептических условий необходимо:
максимально уменьшить содержание воздуха в паро-воздушной смеси, находящейся в аппарате. В частности, нужно тщательно удалять воздух из аппарата перед началом обработки, продувая его текучим паром или вакуумируя;
максимально уменьшать теплопотери, особенно в трудностерилизуемых местах (штуцера, арматура). Для этого такие места должны быть тщательно укрыты теплоизоляцией;
по возможности увеличить диаметр штуцеров и уменьшить их вылет, т.е. не допускать в аппаратах узких и длинных щелей;
по возможности делать более толстыми стенки штуцеров для увеличения потока тепла вдоль стенок за счет теплопроводности;
не допускать загрязнений на внутренних поверхностях ферментеров т.к. они могут привести к понижению температуры стенки, особенно в тех случаях, когда она плохо изолирована.
Целесообразность и эффективность выполнения этих рекомендаций подтверждается практическим опытом.

СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК

Существуют два способа культивирования микробных клеток: периодический и непрерывный. При периодическом способе культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма микроорганизмов. Культивирование, под которым понимается развитие популяции микробов в специальном аппарате, осуществляется большей частью с использованием жидких питательных сред. Схема и основные элементы конструкции типового культиватора для глубинного выращивания микробов представлены на рис. 2.

[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Рисунок 2 – Схема и основные элементы конструкции ферментера

Аппарат снабжен электродвигателем 1 и редуктором 2 для вращения вала, на котором установлена трехъярусная турбинная мешалка 6. Ввод вала перемешивающего устройства герметизирован с помощью торцового уплотнения 3. Отражательные перегородки 5 предотвращают вращательное движение культуральной жидкости и улучшают массообмен. Для отвода тепла, выделяющегося при культивировании и перемешивании мешалкой, предусмотрены теплообменные устройства в виде секционной рубашки 7 и змеевиков 8. Воздух на аэрацию подается через трубу 4, снабженную барботером.
Это так называемый глубинный или суспензионный метод культивирования. При изучении процесса развития популяции микробов основной наблюдаемой величиной является концентрация микроорганизмов.

[ Cкачайте файл, чтобы посмотреть картинку ]

Рисунок 3 – Кривая роста популяции микробов при периодическом культивировании

Процессы роста и развития популяции микробов в периодически действующем аппарате протекают в несколько стадий. Типичная кривая изменения концентрации микробов X от времени
· приведена на рис. 3.
Кривая роста популяции микробов при периодическом культивировании.
S- образный характер этой кривой является универсальным и не зависит от вида микроба и условий культивирования.
Различают следующие основные стадии развития популяции микробов: начальную, рост, равновесие, отмирание.
В свою очередь каждая из этих стадий может быть разделена на несколько фаз. На первой стадии, которая начинается с посева в питательную среду, в первый момент может наблюдаться некоторое снижение концентраций микробов (латентная фаза - I). Затем содержание биомассы возрастает, сначала в результате роста только объема клеток, а затем и вследствие увеличения их количества (лагфаза и фаза ускорения роста - II). Стадия роста включает фазу экспоненциального (логарифмического - III) роста и фазу замедления роста. Затем наступает стадия равновесия (максимально стационарная фаза - IV) и отмирания (гибели) популяции, последняя представляет интерес в случаях, когда целевой продукт выделяется в результате разрушения (лизиса) клеток.
Н.Д.Иерусалимским была предложена математическая модель зависимости коэффициента скорости роста от концентрации продуктов обмена, которая описывает S-образную кривую роста:

S Kp

· =
· max ..--------- ..-------------- (4)
Ks + S Kp + P

где: S- концентрация субстрата, кг/м3;
КS- константа насыщения, кг/м3;

· мах - максимально удельная скорость роста, ч-1;
Р – концентрация ингибирующего продукта обмена в культуральной жидкости, кг/м3;
Кр – константа, кг/м3.
Физический смысл константы Кр заключается в том, что Кр= Р при
· =0,5
· мах, т. е. Кр – это такая концентрация ингибирующего продукта, при которой в условиях высокой концентрации субстрата удельная скорость роста достигает половины своего максимального значения.
Некоторые микробы лучше развиваются на плотных питательных средах и такой метод культивирования, называется поверхностным. Поверхностный метод менее технологичен и применяется в исключительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом.
При непрерывном способе культивирования требуется глубокое знание процесса и его кинетики. При непрерывных процессах больше возможностей для специализации аппаратуры на отдельных стадиях технологии и контроля качества продукта. Кроме того, в аппаратах полного смешения возможно сохранять постоянными параметры процесса и тем самым стабилизировать культуру в желательном для производства физиологическом состоянии.
Условия культивирования микробов в непрерывно действующем аппарате более благоприятны, чем в периодическом. В первом случае среда все время обновляется, поэтому не наблюдается изменений концентрации веществ в результате жизнедеятельности микробов. Поток среды отрегулирован так, что концентрации веществ, биомассы и продуктов обмена поддерживаются постоянными.

2. СОДЕРЖАНИЕ ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ.
ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ

1.Познакомиться со способами стерилизации питательных сред.
2.Изучить порядок подготовки оборудования к работе.
3.Освоить технологию получения нативных культур колибактерина на основе шт. М-17.
4.Изучить порядок завершения выполнения работ на стадии.

СЫРЬЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
К РАБОТАМ ПО ПРИГОТОВЛЕНИЮ ПОСЕВНЫХ И НАТИВНЫХ КУЛЬТУР

Сырье:
Мясо-пептонный бульон РП-153-80
Питательный агар РП-153-80
Среда Эндо РП-153-80
Мясо-пептонный агар РП-153-80
Казеиновый или дрожжевой питательный агар РП-153-80
Среда высушивания РП-153-80
Натрий хлористый ГОСТ 4233
Натрий двууглекислый ГОСТ 2156
Натрий фосфорнокислый 2-х зам. ГОСТ 4172

Реактивы:
Натрия гидроокись, ГОСТ 4328
Фуксин основной, ГОСТ 1738
Йод кристаллический, ГОСТ 4159
Калий двухромовый, ГОСТ 4220
Генциан-виолет, ТУ 6-09-945-76
Фенолфталеин, ТУ 6-09-5360
Спирт этиловый, ГОСТ 5962
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709
Глицерин дистиллированный, ГОСТ 6824
Калий йодистый, ГОСТ 4232-74
Метиловый фиолетовый (метилвиолет), ТУ 6-09-945-76, чда.
Посуда:
Пробирки, ГОСТ 25336
Чашки Петри, ГОСТ 25336
Матрацы стеклянные, ТУ 64-2-181
Флаконы, вместимостью 100 дм3, ТУ 64-2-100
Колбы конические лабораторные, вместимостью, 100, 250см3, ГОСТ25336
Ступка и пестик фарфоровые, ГОСТ 9147

Материалы:
Вата медицинская гигроскопическая, ГОСТ 5556
Марля медицинская, ГОСТ 9412
Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026
Пробки ватно-марлевые лабораторного изготовления
Масло иммерсионное СТУ 21-413
Халат медицинский
Тапочки госпитальные
Респиратор «Лепесток-200»
Перчатки хирургические
Шапочка медицинская

Оборудование:
Ферментер лабораторный, V=1,5л; V=5,0л
Насос вакуумный
Автоклав, ГОСТ 14106
Микроскоп световой биологический, ГОСТ 8284-78

Ход работы

ПОДГОТОВКА ОБОРУДОВАНИЯ (ФЕРМЕНТЕРА)
К РАБОТЕ

Подготовка ферментера включает в себя выполнение следующих операций:
ревизию всей запорной арматуры;
проверку целостности уплотнительной прокладки на крышке аппарата;
проверку наличия заземления;
проверку исправности приборов измерения температуры, рН.

ПРИЕМ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И ЕЕ СТЕРИЛИЗАЦИЯ.

Жидкую питательную среду (ЖПС) заливают в ферментер через крышку в количестве 1/2 2/3 его полного обьема. В ферментер монтируют все необходимые датчики (температура, рН).
Питательную среду вместе с ферментером стерилизуют в автоклаве при температуре 121123оС в течение 2530 мин.


ЗАСЕВ МАТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ.

После стерилизации питательной среды ферментер устанавливают на пульт управления, производят все необходимые соединения (вода, сжатый воздух, вакуум). Берут пробу ЖПС для определения стерильности, рН с соблюдением правил асептики.
Затем в ферментер засевают с соблюдением правил асептики маточную культуру. Плотность посева должна составлять 400600 млн микробных клеток в 1 мл среды.
В качестве пеногасителя используется растительное масло из расчета 1,53 мл на 1 л среды. Содержание ферментера перемешивают в течение 5 мин. и отбирают пробу с соблюдением правил асептики. В пробе контролируют:
отсутствие посторонних микробов;
плотность посева (по стандарту ГИСК);
количество живых клеток в 1 мл;
рН среды культивирования (при помощи рН-метра).

ВЫРАЩИВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ КУЛЬТУРЫ.

Выращивание микробов E.coli штамма М-17 производят в ферментере по следующему режиму:
температура – (37±1)оС;
перемешивание (частота вращения мешалки) – 6001000 об/мин;
аэрация – 12 л/мин на 1 л среды.
В процессе культивирования в ферментер добавляют 40% раствор глюкозы в зависимости от рН среды, который должен быть в пределах 7,47,6 ед. рН в начале выращивания и 7,88,0 ед. рН в конце выращивания. При этом не допускается резких колебаний значений рН.
Каждый час из ферментера отбирают пробы для контроля:
рН среды (при помощи рН-метра, при отсутствии датчика рН);
густоты микробной взвеси.

В последней пробе контролируют дополнительно:
количество живых микробов (высев на агар в чашках Петри);
наличие посторонних микробов (микроскопией мазков, окрашенных по Граму).

МЕТОДИКИ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

Определение общей концентрации (густоты) микробных клеток
Пробу нативной культуры в количестве 0,5 мл разводят последовательно 10 кратным количеством 0,9 %-го раствора хлорида натрия. При этом отмечают количество разводок. Разведение проводят до уравнения мутности пробы с мутностью стандарта ГИСК им. Л. А. Тарасевича, определяемое визуально. Расчет концентрации проводят по формуле:

Х = 0,5 . 2 . 10n, где n – количество разведений

Определение количества живых микробов в нулевой и конечной пробах
Пробу нативной культуры в количестве 0,5 мл разводят последовательно 10 кратным количеством 0,9 %-го раствора хлорида натрия до 8 разведения (в нулевой пробе – до 7 разведения). Затем в мерную пипетку набирают 0,1 мл культуры и производят посев в чашку Петри с ППС.
Посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре (37±1) 0 С. По истечение указанного времени проводят подсчет выросших колоний. Расчет концентрации осущетсвляют по формуле:

Х = 0,1 . 10 . 8n , где n – количество разведений

ЗАВЕРШЕНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТ НА СТАДИИ

Всю стеклянную посуду, ферментер с остатками нативной культуры и вспомагательные матариалы «загрязненные» культурой стерилизуют в автоклаве при температуре (130 ± 1) оС в течение 2 ч.

МИКРОСКОПИЯ ПО ГРАМУ

Подготовка красок
Раствор метилвиолета. 10 г метилвиолета насыпают во флакон с притертой пробкой, наливают 100 мл 96 %-ного этилового спирта и дают этой смеси отстояться (23) сут. Раствор периодически (1 раз в день) перемешивают встряхиванием флакона. 10 мл спиртового раствора метилвиолета смешивают с 90 мл 5 %-ного водного раствора карболовой кислоты.
Раствор Люголя. В 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия, затем добавляют 1 г йода кристаллического. После растворения препаратов объем раствора доводят дистиллированной водой до 300 мл.
Карболовый фуксин Циля. 1 г порошка фуксина основного тщательно растирают с 5 г карболовой кислоты в фарфоровой ступке до получения гомогенной смеси, добавив 25 капель глицерина. Во время растирания добавляют небольшими порциями 10 мл 96 %-ного этилового спирта. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу без комков, добавляют 100 мл дистиллированной воды и перемешивают.
Дают отстояться полученной смеси двое суток, затем фильтруют через один слой фильтровальной бумаги. Раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой в течение 1 года при комнатной температуре.
Рабочий раствор фуксина Пфейфера. К 1 мл карболового фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды. Раствор хранению не подлежит, готовят по мере необходимости.


Проведение анализа
На бумажку наносят раствор метилвиолета на (12) мин. Краску с бумажки удаляют и препарат (12) мин обрабатывают раствором Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на (0,51,0) мин наносят 96 %-ный этиловый спирт. Далее мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают (12) мин рабочим раствором фуксина Пфейфера. После этого краску сливают, препарат промывают водопроводной водой и сушат фильтровальной бумагой. Мазок просматривают под микроскопом с использованием объектива 90х и окуляров 7х. Необходимо просмотреть не менее 50 полей зрения.

МЕТОДИКА ОТБОРА ПРОБЫ

Отбор пробы осуществляется с соблюдением правил асептики. Операция выполняется с соблюдением правила парности. Перед отбором зажечь пламя спиртовки и над пламенем слить остатки микробной культуры в емкость с 5 %-м раствором перекиси водорода. Затем при помощи зажимов Кохера освободить часть трубки от микробной культуры путем ее сильного накручивания на зажимы, расположенные на окончании трубки, и пережать еще одним зажимом. Скрутку отпустить. Ту же операцию провести и на трубке пробоотборника. Над пламенем спиртовки один оператор удерживает сначала трубку от емкости с микробной культурой, а второй – ножницами отрезает у окончания трубки зажимы и убирает их в емкость с дезраствором. Затем второй оператор подает трубку от пробоотборника в руку первому и проводит ту же операцию. Первый соединяет обе трубки через штуцер над пламенем спиртовки. Далее отбирается проба, предварительно освободив трубку от всех зажимов, в необходимом количестве (2040 см3). Затем трубка пережимается 4-я зажимами с небольшим промежутком между парами. Берутся салфетки, смоченные дезраствором, прокладываются: одна – снизу трубки, вторая – сверху. Между ними помещаются ножницы и перерезают трубку. Салфетки пережимаются на разных концах вторыми (от края) зажимами.

МЕТОДИКА ЗАСЕВА МАТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

Операция проводится с соблюдением правил асептики и парности в работе. Все присоединения емкости с маточной культурой к аппарату производятся в соответствии с «Методикой отбора проб».
Введение маточной культуры в аппарат можно выполнить путем вакуумирования аппарата, либо путем создания небольшого давления (через редуктор) в емкости с маточной культурой. После введения маточной культуры в аппарат необходимо провести промывку трубок стерильной дистиллированной водой. Все соединения проводятся в соответствии с «Методикой отбора проб». Введение пеногасителя в аппарат производится аналогично вышеописанному.




МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ (рН)

Операция проводится в вытяжном шкафу. Перед определением рН прибор должен быть включен не менее, чем за 15 минут. Необходимо проверить: наличие калия хлористого в электроде; его чистоту, а при наличие пленки – промыть ацетоном или 1 %-ным раствором соляной кислоты. Затем проверить рН-метр по буферному раствору (рН=6,86 ед.рН).
Перед проверкой электроды промыть дистиллированной водой, высушить фильтровальной бумагой. Пробу налить в стаканчик и поставить под электроды. Точные показания будут через 3 минуты. По окончании замера стаканчик убрать из под электродов и поместить в емкость с дезраствором на 3 минуты, затем промыть их дистиллированной водой. Электроды в процессе хранения должны постоянно находиться в дистиллированной воде.

МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО ГРАММУ

Определение проводят в вытяжном шкафу. На предметное стекло наносят 0,1 см3 микробной культуры с помощью пипетки. На предметном стекле равномерно распределяют пробу и оставляют досушиваться в шкафу на воздухе приблизительно на 20 минут. Затем мазок фиксируют над пламенем спиртовки путем 4-5-ти кратным разведением. Далее по методике, описанной в «Методических указаниях» со слов: «На бумажку».

МЕТОДИКА РАСЧЕТА ПЛОТНОСТИ ПОСЕВА

Для того, чтобы узнать, какое количество посевного материала необходимо ввести в аппарат, необходимо знать:
1 концентрацию приготовленного ПМ, млрд.кл. в см3;
2 объем ЖПС дм3.
Согласно «Методических указаний » плотность посева должна составлять 400600 млн. микробных клеток в см3. Расчет необходимого количества МП проводится по следующим формулам:

Спм
С1 = ----------- (1)
Vжпс


ПД
Vпм = --------- (2)
С1

где: С1 – концентрация ПМ после разведения ЖПС, млрд.кл. в см3;
Vжпс – объем питательной среды, дм3;
Спм – концентрация приготовленного ПМ, млрд.кл. в см3;
ПД – необходимая плотность посева, млрд.кл. в см3;
Vпм – объем посевного материала, см3 или дм3.

3. ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ.

Стерилизация питательных сред.
Методы культивирования, использующиеся в биотехнологической практике.
Способы контроля стерильности посевных и нативных культур.
Технологические параметры культивирования экспериментального производства колибактерина.
Основные элементы конструкции типового аппарата – культиватора.
Кривая роста популяции микробов и характеристика фаз процесса периодического культивирования.
Математическая модель Н. Д. Иерусалимского.
Стерилизация оборудования.
Определение густоты микробной взвеси.
10. Определение количества живых микробов.
11. Окраска по Граму.

4. ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

Егорова Т. А. Основы биотехнологии. М.., - 2003.
Регламент производства. ПР – 153 – 80. Колибактерин сухой. Утв. 20. 06. 1980.
Пименов Е. В., Дармов И. В., Бакулин М. К. Микроорганизмы в биотехнологических производствах. – Киров, 1997.
Бакулин М. К. Приготовление питательных сред и подготовка посуды для культивирования микроорганизмов. Виды питательных сред. Техника посева микроорганизмов в жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды. – Киров, 1997.

СОДЕРЖАНИЕ
1.
Общие сведения..
3


Краткие сведения о колибактерине.
3


Способы стерилизации питательных сред..
3


Способы культивирования микробных клеток
5

2
Содержание лабораторного занятия..
8


Цели занятия..
8


Сырье, материалы, реактивы и оборудование
9


Ход работы.
10

3
Вопросы по теме занятия.
14

4
Литература по теме занятия.
14


13PAGE 15


13PAGE 14215





Приложенные файлы

  • doc 14697424
    Размер файла: 147 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий