КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И РОСТ

Закономерности роста чистых культур при периодическом перемешивании. Кривая роста, особенности отдельных фаз. Рост микроорганизмов при непрерывном культивировании.
Математическое выражение роста культур в непрерывных условиях. Значения непрерывного культивирования для изучения свойств микроорганизмов и для их практического использования. Синхронные культуры, способы получения и значение.


1. Культивирование. Накопительные культуры и принцип селективности. Чистые культуры микроорганизмов. Методы получения и изучение. Основные типы сред, используемые для культивирования микроорганизмов (по составу и физическому состоянию). Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов, метод Хангейта. Поверхностное и глубинное выращивание.

Культивирование микроорганизмов проводится с целью увеличить кол-во материала (работа с популяцией микроорганизмов).
Накопительные культуры:
Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганизмов (за счет накопления определенной группы в селективных условиях, где другие группы либо не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом). Специфические питательные среды, удовлетворяющие потребности преимущественно одной группы микроорганизмов- элективные=селективные (среда Эшби является элективной для рода Azotobacter).

Чистые культуры:
Она может быть получена из отдельной колонии или одной клетки (клетки одного вида).
Посев по Коху: накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды.
Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную и охлажденную до 50 питательную среду, содержащую агар или желатину, в стерильные чашки Петри. После застывания на поверхность наносят каплю культуры и растирают шпалелем,потом этим же шпателем растирают в 2-й,3-й,4-й чашках.
Так же можно посеять истощающим способом петлей (как сеяли на практикуме,делим на сектора чашку, и захватывая одну линию траектории, размазываем по секторам. Перед каждым размазыванием петлю прожигают
После посева в термостат крышками вниз,что бы конденсат не закапал среду.
Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.

Типы сред:
1). По физическому состоянию могут быть
жидкими, применяют для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.
полужидкими, реды получают добавлением к жидким средам 0,5 % агара и используют для специальных целей, например культивирования анаэробных микроорганизмов.
твердыми (плотными) Они необходимы для выделения чистых культур микроорганизмов, в диагностических целях, для количественного учета микроорганизмов, хранения культур и в ряде других случаев.
сыпучими.(Стандартность, простота хранения, транспортировки и изготовления делают их весьма удобными для работы).
2). по химическому составу:
На мономерах, к.пр., нельзя создать селективную среду, на части полимеров тоже (крахмал, большая часть белков); хитин, коллаген-селективны. В среде должны присутствовать необходимые питательные вещества: фосфаты, различные макро- и микроэлементы (Cl,K,Na,Ca,Mg,Fe,).
Стандартная неселективная среда – БСА: мясо-пептонный бульон (МПБ) и неохмеленное пивное сусло с концентрацией сахара 4град. (в соотношении 1:1) с 2% агара.
Для создания селективных условий необходимо добавление в среду специфических веществ, например, при выращивании азотфиксаторов, не нужно добавлять азот (=> вырастут те, кто умеет улавливать его из воздуха); нитрификаторы – NH4,NO2; денитрификаторы – NO3; сероокисляющие бактерии- S; сульфатредукторы – сульфаты; серные бактерии – H2S,

Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов:
на поверхности жидких и плотных сред поверхностное культивирование или внутри жидкой питательной среды глубинное культивирование. При поверхностном культивировании кислород в клетки из воздуха,использовать ч петри или колбы Виноградова.
При глубинном культивировании среду надо аэрировать
При аэрации два показателя: интенсивность и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кислорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Степень аэрации это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.
Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования выращивание на качалках+отбойники в колбах
2). Анаэробные микроорганизмы:
более сложно, чем культивирование аэробов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено.
Выращивание в высоком слое среды.
Метод культивирования в вязких средах. Вязкость сред легко увеличить добавлением к ним 0,2 0,3 % агара.
Для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толще питательной среды.
Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах вакуумных металлических камерах, снабженных манометром.
Метод Хангейта:
Культивирование строгих анаэробов.
1) все процедуры приготовление и разлив сред, посевы, культивирование микроорганизмов и т.д., проводят с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа, использование герметически закрытых сосудов и т.д.); 2) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кислорода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки; 3) все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, продутых газом, не содержащим кислород; 4) все трубки и шланги, используемые для пропускания газа, должны быть изготовлены из материала, не допускающего (медь) или допускающего в слабой степени диффузию сквозь него кислорода воздуха (бути-лированная резина).
В качестве поглотителя кислорода из газов в лабораторной практике используют щелочные растворы пирогаллола или дитионита натрия, металлическое железо, медь, нагретую до 400 °С, или некоторые другие реактивы.
Для удаления следов кислорода из промышленных газов, которые поставляют в баллонах, содержащих до 1,5 % воздуха, используют следующую процедуру: газ пропускают через стеклянную трубку, заполненную медными стружками и нагретую до 400 °С с помощью электронагревателя .

2. Рост микроорганизмов. Рост отдельных микроорганизмов и популяций (культур). Сбалансированный и несбалансированный рост. Возможные причины несбалансированного роста. Основные параметры роста культур: время генерации, удельная скорость роста, выход биомассы, экономический коэффициент.

Периодическое культивирование.
Лаг-фаза фаза «привыкания» клеток к среде удлиняется, если использовать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки из экспоненциальной фазы роста перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия
В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях.
По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, а затем – в фазу отмирания, которая иногда также имеет логарифмический характер.
Экспоненциальный микробный рост изображается на полулогарифмическом графике в виде прямой линии. Важной характеристикой культуры является константа скорости роста ц, которая зависит от условий выращивания (если условия стандартные, то для данной культуры она совершенно определенная).
Если рассматривать популяцию не как набор индивидуальных особей, а как саморазмножающуюся систему, то скорость изменения плотности такой системы пропорциональна самой плотности, т.е. изменение следует кинетике реакций первого порядка. Тогда имеем

Различают сбалансированный рост, когда увеличение всех вешеств и структур происходит пропорционально. Если в среде нехватка или избыток чего-нибудь, то рост становится несбалансированным, т.е. какие-то продукты метаболизма могут преобладать. Этим приемом пользуются для направленного синтеза необходимых соединений.
Время генерации = время удвоения: G=t/n=1/v, где n-число делений, v-константа скорости деления;
выход биомассы: М=Мmax-М0(исходн.);
экономический коэффициент: Y=М/S(отношение выхода биомассы к потребленному субстрату).
3. Закономерности роста чистых культур при периодическом перемешивании. Кривая роста, особенности отдельных фаз. Рост микроорганизмов при непрерывном культивировании.
Математическое выражение роста культур в непрерывных условиях. Значения непрерывного культивирования для изучения свойств микроорганизмов и для их практического использования.


Проточная система культивирования позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Существуют два принципиально разных типа непрерывных культур хемостаг и турбидостат.
В хелюстате фиксируется какой-нибудь химический параметр процесса (концентрация субстрата, кислорода). Эта концентрация является лимитирующей.
Если объем сосуда обозначить череч V, а скорость притока ,/ (л/ч), то скорость разбавления определяется по формуле


Если скорость прироста it скорость вымывания раины, то система находится в состоянии динамического равновесии.
Зависимость константы скорости роста и от концентрации субстрата С, описывается кривой насыщения,где Кх- концентрация субстрата,при которой мю равна маленькому выраженьицу ниже


Работа турбидостата основана на поддержании постоянной плотности бактериальной суспензии. Фотоэлемент измеряет плотность вытекающей суспензии и автоматически изменяет проток (чем плотнее культура, тем больше подается среды). В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближена к максимальной. При гаком принципе работы возникают технические проблемы пристеночного обрастания поверхностей, в том числе и фотометрической кюветы.















Синхронные культуры, способы получения и значение.
все клетки в популяции делилятся одновременно (синхронно).
Для этого используют различные приемы получения синхронных культур:
и получение клеток одного размера путем фильтрации или нпфференциального центрифугирования;
резкое изменение температуры инкубации;
воздействие света и т.д.
При этом кривая роста получается ступенчатой Обычно удается синхронизировать не более трех делений, а потом культура снова переходит к асинхронному делению.


15

Приложенные файлы

  • doc 14697429
    Размер файла: 230 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий