ХБП методичка

ЛЕПНЫЕ РАБОТЫ ПРИ ОФОРМЛЕНИИ НАГЛЯДНЫХ ПОСОБИЙ
Инструменты и оборудование
Ножи с нескладывающимися лезвиями, например сапожный.
Стеки, деревянные (а2) и с металлическими наконечниками, применяют для работы с такими деталями, которые неудобно делать пальцами. Размеры и форма концов у стеков весьма различны.
Долотами полукруглыми и прямыми выравнивают плоскости и расчищают готовые отливки (б).

Рис. Инструменты и оборудование для лепных работ: а1 - нож; а2 - стеки деревянные; а, - стеки металлические; б - долота; с - цикля; г - гипсовка; д - мерник; е - мольберт; ж - станок.

Цикля (б) - металлическая пластинка с одним гладким и одним зубчатым краем. Наиболее распространены цикли толщиной 1,5, длиной 100, шириной 60 мм. Циклей выравнивают изделия, отлитые из гипса и вылепленные из глины.
Гипсовки различных размеров (г) - чашки или миски из черной резины для гипсового раствора. Легко очищаются от засохших остатков гипса.
Мерник (д) - прибор для измерения высоты деталей вещи, которую лепят.
Мольберт для лепки (е). Состоит из подставки высотой около 2 м и доски размером 1х1 м. На передних ножках подставки располагают отверстия, удаленные друг от друга на 150 мм, предназначенные для клиньев, переставляя которые можно установить доску на необходимую высоту. Мольберт применяют при лепке плоских объектов.
Станок (ж) необходим при лепке объемных предметов. Сверху станка помещают вращающуюся подставку, а между ножками - полочку для инструментов. Желательно, чтобы высота станка была равна высоте груди человека, выполняющего скульптурную работу.
Кроме этих основных инструментов, необходимо иметь линейку деревянную с миллиметровыми делениями и линейку металлическую, циркуль, измеритель, ножницы канцелярские, шило, киянку, молоток, лобзик, клеянку, спринцовку, кисти (флейцы и ручники).
Материалы
Глина - самый доступный материал. Особенно хороша так называемая скульптурная глина бело-серого цвета и хорошей пластичности. В такой глине при высыхании не образуется трещин. Чаще, однако, приходится работать с более распространенными глинами желтого цвета различных оттенков. По качеству они хотя и хуже, но для лепки пригодны. Качество глины в значительной мере определяется количеством в ней примесей, в частности песка.
Из глины, заготовленной для лепки, удаляют мусор и песок. Для этого глину разводят водой до консистенции меда. Как более легкая, глина будет находиться во взвешенном состоянии, а камешки и песок осядут на дно. Верхние две трети глиняного раствора переливают в другой сосуд, а нижнюю треть, как загрязненную примесями, выбрасывают. Такой процесс повторяют. Раствору дают отстояться, воду сливают и из подсушенной глины формируют кирпичики. Предохраняя от высыхания, кирпичики покрывают мокрой мешковиной и хранят в плотных ящичках.
Из глины обычно лепят черновые модели, с которых отливают из гипса слепки - формы. Формы заливают гипсом, воском и некоторыми другими веществами и получают чистовую модель.
Пластилин - модельная масса более сложного состава. Продается в готовом виде, но может быть легко изготовлен и собственными силами. Рецептов для изготовления пластилина много. Довольно хороший пластилин получают при смешивании технического глицерина с плотной тестообразной глиной. Глицерин добавляют до тех пор, пока глина не потеряет свойство прилипать к рукам. Хороший пластилин получается и при смешивании 5 весовых частей пылеобразной глины с 1 весовой частью топленого пчелиного воска и небольшим объемом глицерина, взятого в таком количестве, при котором пластилин перестает прилипать к рукам. К пластилину можно добавлять порошкообразные краски и получать массу любого цвета. Пластилин дороже глины и применяется для лепки небольших объектов.
Перед работой пластилин кладут в теплое, но не жаркое место, что повышает его пластичность. Непосредственно перед работой порции пластилина разминают в руках.
Клеевое тесто. Порошкообразный мел или порошкообразную глину смешивают с таким количеством теплого жидкого столярного клея, чтобы получилась тестообразная масса, пригодная для лепки. Клеевое тесто довольно скоро затвердевает и в запас не готовится. Оно пригодно как для лепки черновых моделей, с которых в дальнейшем отливают формы, так и для поделки вполне оформленных изделий.
Бумага на клею. В жидкий раствор столярного клея погружают на 10 минут мягкие сорта бумаги (оберточную, газетную). Бумага на клею хороша для лепки рельефа местности при изготовлении макетов.
Гипс бывает строительный, хирургический и формовочный.
Строительный гипс плох, хирургический дорог, формовочный, как об этом говорит само название, наиболее подходит для отливки форм. Формовочный гипс - белый мелкий порошок, жадно поглощающий влагу. Подмоченный или отсыревший гипс для формовки непригоден. Хранить гипс нужно в совершенно сухом месте в хорошо закупоренных сосудах. Гипсовые растворы начинают схватываться (затвердевать) не ранее 4 минут после затворения (размешивания с водой). Конец схватывания наступает не позднее 20 минут. При желании ускорить схватывание гипс затворяют теплой водой (40°) либо в раствор добавляют 1% квасцов или 1-2% поваренной соли. При необходимости затормозить процесс схватывания, раствор делают на холодной воде, добавляя на каждое ведро воды 4 столовые ложки разведенного столярного клея, или желатина, или небольшое количество обезжиренного молока. Гипс разводят до консистенции сметаны, всыпая его в воду, но не наоборот. Лучше это сделать так. Сначала гипс равномерно распределяют по поверхности воды и дают 0,5-1 минуту впитать влагу, а затем быстро перемешивают 1,5-2 минуты до образования однородной массы. Чтобы приготовить цветной раствор гипса (оплеску), на ведро воды всыпают столовую ложку краски. Гипсовые растворы надо делать быстро, в 1-1,5 минуты; промедление резко снижает качество; гипс или не будет вообще схватываться или образует хрупкую массу, рассыпающуюся при малейшем давлении.
Гипсовый раствор удобен для формовочных работ не только тем, что он быстро схватывается, но и способностью значительно увеличиваться в объеме, что улучшает проникаемость его во все углубления формы. Изделия из гипса сушат при температуре около 50°, устанавливая их не на сквозняке, иначе гипс покоробится и потрескается.
Техника лепки рельефных моделей
Рельефные модели лепят или с натуры, что лучше, или с рисунка, сделанного на бумаге. К рельефным лепным изделиям относятся орнаменты, барельефы, обрамления, заставки и виньетки, широко применяемые для украшения витрин, выставок, стенных газет. Рельефной лепкой можно удачно изобразить части растений, органы животных, детали машин.
На мольберте укрепляют подставку, припрессовывают к ней слой глины, так называемый фон, толщиной 2-5 см и с поверхностью, превосходящей основание создаваемого объекта примерно на 5 см. Острым предметом на фоне рисуют контуры объекта, например листа, по контуру накладывают глину и, в основном пальцами, придают ей грубый облик листа. На этой черновой фигуре отмечают основные линии и точки, в нашем случае жилки листа. А далее уже различными стеками и другими инструментами отделывают скульптуру окончательно. Около жилок счищают слой глины, жилки округляют, углы у листьев заостряют и отрабатывают все остальные, подчас мелкие детали, которые, однако, совершенно необходимы для приближения изделия к натуре. При лепке обрамлений, у которых закономерно повторяется одна и та же деталь, нет надобности лепить все обрамление целиком, лепят только повторяющуюся часть, а также левый и правый углы, а если есть, то и концовки.
Чтобы изготовить модели плоских геометрических орнаментов (меандр, триглиф), из гипсового раствора отливают плиту толщиной около 2 см и длиной, равной 3-4 повторяющимся элементам. На высохшей плите делают рисунок, по контуру его на необходимую глубину прорезают, а затем стамеской или долотом выбирают гипс, обращая особое внимание на отделку углов и остроту и прямолинейность кромок.
Изготовление модели венка или гирлянды. Модель делают из глины, накладывая ее на гипсовую толщиной в 5 см плиту. Чтобы изготовить модель круглого венка, необходим вращающийся шаблон с профилем полувала. В центре гипсовой плиты оставляют отверстие, в котором гипсом закрепляют ось шаблона (рис. 156). На плите, вокруг оси как центра, вычерчивают контур венка, по которому укладывают глину и придают ей грубо форму полувала, а окончательно отделывают вращающимся шаблоном. На глине вычерчивают детали рисунка и вырезают его подходящим режущим инструментом. На отдельные, значительно возвышающиеся части рельефа, можно добавлять необходимое количество глины. Вместо глины при лепке мелких предметов, особенно со сложным тонким рисунком, применяют и более дорогие модельные массы (пластилин и модельный воск).

Рис. Изготовление обрамлений

Небольшие вещи лепят без каркаса, для больших делают каркас. Он облегчает процесс лепки, снижает вес и увеличивает прочность изделия, экономит материал. Каркасы бывают из проволоки или деревянных реек. Деревянные каркасы хуже: они тяжелее, изготовление их сложнее, глина на деревянных каркасах держится хуже и быстрее трескается. Перед укладкой глины деревянный каркас пропитывают водой, иначе дерево, впитывая влагу, покоробится и испортит объект.
Модели многих вещей легко вылепить по шаблону, это ускоряет лепку, а главное крайне упрощает изготовление серии одинаковых предметов. Шаблоны могут

Рис. Шаблон, вращающийся по кругу. Применяется для изготовления модели круглого венка.

быть сделаны для вращения по кругу и для поворота на 180°. Первые применяют для изготовления таких целостных моделей, с которых можно снять слепки без разделения их на части, посредством вторых вытягивают не целую модель, а только ее часть, например продольную половину вазы.
Для примера рассмотрим, как вытягивают шаблоном внешнюю форму черновой модели. Такие модели служат для выклейки по ним изделий из папье-маше и для отливки форм, используя которые отливают чистовые модели.
Сделать шаблон, вращающийся вокруг оси на 360°, не сложно. На бумаге рисуют контуры предмета, в нашем примере - фарфоровой ступки, переводят на фанерный лист вертикальную половину чертежа, выпиливают контур ступки лобзиком, контур заостряют, срезав у него фаски (а), образовавшийся острый край будет режущей частью шаблона. В центре доски размером 30x30 см сверлят отверстие, протягивают через него металлический стержень с загнутым нижним концом - ось шаблона (б). Нижний конец оси прибивают гвоздями к нижней поверхности доски. Из жести вырезают шарнир (в), прикрепляют его к верхней части шаблона.
Кусок глины укладывают вокруг стержня и придают ему форму, приближающуюся к форме ступки, глину смачивают водой. На ось надевают шарнир и, медленно вращая шаблон, срезают излишек глины, в некото

Рис. Шаблоны, вращающиеся вокруг оси на 360°.

рых местах, наоборот, глину приходится добавлять. Не всегда работа удается сразу, иногда ее приходится повторять несколько раз, пока не образуется модель с безукоризненной формой. Вынув стрежень и замазав глиной отверстие, получают готовую модель ступки с ее внешней стороны.
Вазу можно вылепить по шаблону, вращающемуся на 180° (рис. 158). Из фанеры делают шаблон с вырезанной вертикальной половиной контура вазы, укрепляют его на доске двумя шарнирами (а). На фанерную дощечку-основание (б), прибитую гвоздиками к доске, укладывают глину, придают ей форму вазы И завершают отделку, вращая шаблон в ту и другую сторону; готовую половинку модели вазы снимают вместе с фанерным щитком.
Такие предметы, как балясины, высокие, но неширокие вазы изготовляют на специальных токарных станках (рис. 159). В станке неподвижно укрепляют деревянный шаблон (а) с профилем, окованным металлом. Выше шаблона в подшипниках закрепляют вращающееся веретено (б). На веретено наматывают пропитанную гипсовым раствором пеньку слоем около 2 см, а сверху намазывают гипсовый раствор. Вращая веретено, срезают излишек гипса, пока не получится необходимая



Рис. Шаблон с вращением на 180°.
Рис. Станок с неподвижным шаблоном и вращающейся моделью.

форма. Деревянное веретено оставляют внутри изделия, что придает вещи прочность.
Модели с полусферическим или чашеобразным углублением изготовляют также на особых станках (рис. 160) с шаблоном в виде крыла (а), вращающегося вокруг вертикальной оси.
Все рассмотренные здесь лепные работы, если они выполнены из глины, не служат самоцелью, а являются только этапом в процессе создания оформленной продукции. Например, готовую глиняную модель (серп и молот), не снимая с доски, окружают ограждением из глины или пластилина. Модель и внутреннюю поверхность ограждения смазывают вазелином и заливают гипсом. Полученная форма будет пригодна для отливки гипсовых изделий и для выклейки по ним папье-маше.



Рис. Станок с шаблоном для вытягивания чашеобразных углублений.
Рис. Изготовление черновой формы с глиняной модели, окруженной глиняным ограждением.

Формы и их изготовление
Форма служит для размножения (отливки) копий какой-либо вещи или для однократного воспроизводства модели. В соответствии с указанными целями различают следующие разновидности форм.
Гипсовую черновую (одноразовую), годную только для однократного воспроизводства модели. Гипсовую чистовую (многоразовую). Клеевую и желатиновую (многоразовые).
Цементную, деревянную и металлические (многоразовые).
По степени сложности формы подразделяют на простые, среднесложные и сложные. Простые формы служат для изготовления плоских отливок. Такие формы обычно состоят из одного куска. Среднесложные формы могут состоять из одного или из нескольких кусков, а сложные - из многих кусков.
С модели из мягкой глины обычно снимают только гипсовые черновые (одноразовые) формы, так как изготовление чистовых, а тем более многокусковых форм сопровождается искажением модели. Перед формовкой глиняную модель смазывают вазелином или смачивают водой, отчего гипс не прилипает к глине, хорошо растекается по поверхности модели без образования пустот. Модель удобно смачивать из пульверизатора, пока поверхность глины не примет увлажненный блестящий вид. Чрезмерное увлажнение недопустимо. Излишек воды, заполнив углубления рельефа, вызывает разжижение, а следовательно и пористость гипса. С глиняной модели невысокого рельефа можно снять и клеевую форму, но для этого глину предварительно 2-4 раза лакируют «ли покрывают сиккативом.
Модель из пластилина сначала покрывают лаком или сиккативом, а затем олифой.
Модель из воска лакируют шеллачным спиртовым лаком, а затем растительным маслом.
Модель из полированного дерева 2-3 раза покрывают спиртовым шеллачным лаком, а из неполированного дерева - мыльной пеной, полученной из светлых сортов мыла, взбитого в горячей воде с добавлением минимального количества сурепного масла.
Модели из металла лакируют 2-3 раза шеллачным лаком.
Модели из полированного камня покрывают шеллачным лаком, а модели из неполированного камня - мыльной водой, в которую добавлен тальк.
Изготовление форм из гипса и отливка по ним чистовых моделей
ИЗ гипса можно отлить черновую или кусковую форму. С черновой формы в большинстве удается отлить только один экземпляр готовой модели, так как эта форма при выемке из нее модели ломается. Кусковая форма в зависимости от сложности модели может состоять из одной, двух и большего числа частей.
По кусковой форме отливают несколько моделей.
При отливке черновых форм с плоских глиняных моделей модели обильно смачивают водой и обливают цветным гипсовым раствором - оплеской, создавая слой не более 5 мм. На оплеске формируют выступы грибовидной формы для лучшей связи со вторым, белым, слоем гипса - поддерживающим. Поддерживающий слой накладывают только после схватывания оплески. Толщина поддерживающего слоя зависит от величины и структуры черновой формы; излишняя толщина увеличивает вес, слишком малая толщина не обеспечивает достаточную крепость формы. Оплеска необходима как сигнальный слой, показывающий место, где черновая форма соприкасается с моделью, что очень важно при снятии формы с модели.
Через час после укладки поддерживающего слоя черновую форму снимают. Если это затруднено, заостренным предметом отделяют и приподнимают в одном месте край черновой формы от доски, на которой покоится и форма и модель. В образовавшееся пространство льют воду. Размывая глину, вода облегчает снятие формы. Снятую черновую форму очищают и отмывают от кусков и следов глины.
Отливка чистовой модели по черновой форме из гипса
Готовую черновую форму надо как можно скорее использовать для отливки модели. При продолжительном хранении гипс коробится и форма искажается.
Приступая к отливке, подготавливают черновую форму. Сначала ее погружают в холодную воду на 30 минут, потом внутренние поверхности смачивают 5-про-центнОй мыльной водой, прилегающие друг к другу поверхности половинок формы смазывают вазелином и связывают между собой, а в образовавшуюся полость заливают гипсовый раствор.
Есть и другой, хотя и мало распространенный, но очень хороший способ. Черновую форму подсушивают, внутренние поверхности лакируют спиртовым лаком, вновь сушат, смазывают вазелином. Черновая форма легко снимается с отлитой модели, что предохраняет модель от повреждений.
Модель можно отлить цельнолитую или пустотелую. При отливке цельнолитой модели всю полость черновой формы заливают раствором гипса. Это делают быстро, но постепенно.
Одномоментное вливание в форму большого количества раствора может привести к тому, что воздух не будет вытеснен гипсом из отдаленных, в особенности из узких полостей, в результате образуются дефекты - пустоты. Цельнолитые модели крепки, но слишком тяжелы и не экономичны.
Отливая пустотелую модель, в полость черновой формы вливают умеренное количество гипсового раствора и тотчас же, вращая форму во все стороны, делают ока тку, то есть распределяют раствор по всей внутренней поверхности формы.
Окатку с перерывами в 10 минут повторяют 2-3 раза и доводят толщину стенки, в зависимости от величины модели, до 1-5 см.
Весьма ответственный процесс - снятие формы с модели. Это делают часа через полтора - два после заливки гипсового раствора. С кусковой формы снимают веревки, в нескольких местах в шов, разъединяющий половинки формы, осторожно вбивают клинышки и пытаются отъединить половинки формы друг от друга и от модели. Однако это удается редко и то главным образом в тех случаях, когда форма была обработана лаком и вазелином. Чаще же форму снимают кусочками. Такой способ называется расколоткой формы. Форму расколачивают ножом, стамеской или зубилом с применением молотка. Чтобы облегчить расколотку и сохранить модель на черновой форме, можно вырезать бороздки, делящие ее поверхность на небольшие квадратики. Вырезая бороздки и расколачивая форму, внимательно следят за оплеской, появление которой сигнализирует о близости модели.
Заканчивая изготовление модели, удаляют с ее поверхности прилипшие посторонние частицы, заравнивают гипсом царапины и случайные выемки, а шероховатые места зачищают мелкозернистой шкуркой.
Техника работ с применением клеевых форм
Клеевые формы при снятии их с моделей не ломаются, поэтому применяются при серийном производстве моделей. Клеевые формы снимают только со скульптур, сделанных из твердых материалов (металла, гипса, камня, дерева). В качестве материала для клеевой

Рис. Изготовление клеевой формы с плоской модели.

формы используют только крупчатый и плиточный столярные клеи. Техника варки столярного клея детально описана в разделе о работе с деревом. Использованную форму вновь расплавляют, а клеевую массу применяют для изготовления другой клеевой формы. Загустевший клей разбавляют небольшим количеством воды. Для сохранения эластичных свойств клей варят на глицериновой воде (30-40 мл глицерина на 1 л воды).
Техника изготовления клеевых форм для плоских моделей существенно отличается от техники изготовления форм для высоких моделей. В первом случае клеевые формы готовят открытым способом, во втором - закрытым, который значительно сложнее.
Клеевые формы для плоских моделей. Как пример рассмотрим работу по изготовлению клеевой формы виньетки.
Черновую модель, если она сделана из гипса, покрывают спиртовым лаком, который сглаживает пористость. Модель укрепляют на гипсовой плитке или дощечке, по длине и ширине превосходящих основание модели миллиметров на 80. Вокруг модели, отступя на 15 мм, устраивают бортик высотой на 15 мм выше поверхности черновой модели (рис. 162). Стенки бортика располагают с небольшим наклоном, сближающим их верхние края. Материалом для бортика может быть глина, пластилин, тонкие дощечки, жесть. Черновую модель, плитку и внутреннюю поверхность барьерчика смазывают тонким слоем жировых веществ, ни в коем случае не допуская скопления жира в углах и в мелких деталях рисунка модели.
Если жир в этих местах все же скопится, его удаляют мягкой кисточкой или маленьким ватным тампоном, навернутым на заостренную палочку. В качестве смазки применяют слегка нагретый вазелин, или растительные масла, или специальные смеси, например смесь 1 весовой части расплавленного и доведенного до кипения стеарина с 2 весовыми частями керосина. Смесь употребляют в охлажденном состоянии.
Закончив подготовительные работы, черновую модель по краям бортика заливают клеевой массой, нагретой до температуры не выше 60°. Более горячий клей обезжирит поверхности, смазанные жиром. Клей застывает сутки, после чего барьерчик удаляют и форму снимают. Клеевые формы, будучи очень эластичными, от небольшого давления или при установке на неровной поверхности легко изменяют форму и искажают внешность отливок.
Отливать модели можно без добавочного укрепления клеевой формы, но работать гораздо удобнее, если для нее сделать дополнительный гипсовый футляр. На тыльной поверхности формы, еще не снятой с черновой модели, вырезают четыре лунки-замка, срезают кромки (б), тыльную поверхность и боковые стенки модели и поверхность плиты смазывают жиром и всю форму обкладывают раствором гипса толщиной 1015 мм (в). В толщу еще несхватившегося гипса можно вдавить проволочки или тонкие лучинки, что еще больше укрепит футляр. Если клеевая форма велика, поверх первого гипсового слоя накладывают второй, доводя толщину футляра до 30 мм. Подсохший футляр снимают с клеевой формы, окончательно высушивают и дважды покрывают внутреннюю поверхность лаком. Перед укладкой формы поверхность футляра посыпают тальком, что облегчает и укладку и выемку формы. Укладывать форму в сырой футляр нельзя, иначе она впитает влагу и изменит конфигурацию. Для укрепления клеевой формы ее дважды дубят раствором квасцов. Вначале поверхность осторожно протирают тальком. Излишний тальк, особенно скопившийся по углам рисунка, сметают мягкой кисточкой. Форму обильно увлажняют 30-процентным раствором жженых калиево-алюминиевых квасцов и оставляют на 2 часа для просушки. Обработку тальком и квасцами повторяют. После повторного дубления форму сушат более основательно - часов восемь. Высохшая клеевая форма полностью готова для отливочных работ.
Работа с папье-маше
Вещи из папье-маше выклеивают из маленьких кусочков бумаги или вылепляют из бумажной массы.
Самые плохие сорта непроклеенной бумаги (газетной, оберточной) - лучший материал для изготовления вещей из папье-маше.
Бумажную массу готовят и применяют так. В сосуд укладывают бумагу, заливают ее горячей водой, укутывают тряпкой и выдерживают в теплом месте несколько дней, но не менее одного дня. Сосуд нагревают, доводя воду до кипения, бумажную массу основательно перемешивают. Сливают воду, бумажную массу укладывают в мешочек, отжимают, формуют шарики величиной не больше грецкого ореха. Шарики высушивают не на сильном жару, медленно, несколько дней, но чтобы масса не заплесневела. Сухие шарики растирают в мелкий порошок руками или на терке. Порошок хранят в хорошо закупоренной банке. Непосредственно перед работой из него готовят бумажную массу, не делая запаса. Одну весовую часть бумажного порошка смешивают с одной весовой частью порошка мела. Варят два клея, один из 1/5 весовой части картофельной муки, другой из 1/10 части столярного клея. Оба клея смешивают и приготовляют тестообразную массу, добавляя смесь из мела и бумажного порошка. Бумажная масса хороша для выклейки изделий по формам ажурного рельефа. Перед выклейкой форму смазывают тончайшим слоем вазелина или какого-либо другого жирового вещества.
Бумажные кусочки ни в коем случае не следует нарезать. Нарезанные кусочки склеиваются хуже, кончики у них заворачиваются, шов хорошо виден. Гораздо лучшие результаты получаются при наклеивании оторванных кусочков. Хорошо намоченную и отжатую бумагу расправляют на клеенке, одну сторону намазывают клейстером. Взяв в одну руку кусок такой бумаги, другой рукой отрывают кусочки размером 20x20 мм и наклеивают их на модель. Первый слой накладывают из бумаги мокрой, но не смазанной клеем. Все кусочки краями должны несколько налегать друг на друга. Чтобы избежать пропусков и напластований, первый слой выклеивают бумажками одного цвета, второй - бумажками другого цвета и т. д.
Небольшие объекты выклеивают из 4-5 слоев, крупные - иногда до 15. Одновременное наслоение такого большого количества мокрой бумаги может испортить работу, лучше сначала выклеить 5-6 слоев, дать изделию 1-2 дня подсохнуть, после чего работу можно продолжать.
Вещи из папье-маше выклеивают по специально, сделанным моделям или по обычным готовым образцам, например по пиале, арбузу, мертвой голове животного.
Если бумагу наклеивать на модель нельзя, с модели отливают форму, которую и обклеивают.
Чтобы изготовить из папье-маше предмет, состоящий из двух симметричных половинок, готовят только половину формы и по ней выклеивают две половинки вещи, которые затем оклеивают. Половинчатую форму готовят так. На симметричном предмете проводят линию, делящую его на две равные части; одну из половинок смазывают вазелином. В жестяную или деревянную коробку вливают гипсовый раствор и сразу же погружают в него модель до отмеченной линии (а). Как только гипс затвердеет, модель вынимают, и форма готова (б). Если предмет несимметричен, приходится делать не одну, а несколько форм, снимая слепки с отличающихся частей модели.
Вогнутые формы весьма удобны для выклейки по ним изделий из папье-маше. Выклеивать удобно такую вещь, которую, после обклейки ее бумагой, можно в целом виде или снять с модели, или вынуть из нее; например, папье-маше, выклеенное по готовому блюдцу, по его наружной поверхности или по внутренней поверхности гипсовой модели пиалы. Иногда сначала выклеивают раздельно две симметричные половинки, а потом их склеивают. В ряде же случаев, чтобы снять папье-маше с модели, с формы или с готовой вещи, приходится разрезать выклейку на несколько частей и в последующем склеивать их между собой. У неко



Рис. Отливка одной из половинок предмета, который можно разделить на две симметричные части.
Рис. Разрезы из папье-маше, выклеенного по наружной поверхности чайника.

торых снятых с моделей вещей, например у блюдца, края неровны. Чтобы выровнять край, на блюдце находят центр, циркулем намечают окружность и по ней острым ножом или ножницами срезают лишнюю бумагу. Изделия, разрезанные на части, на стыках склеивают столярным клеем, а швы заклеивают кусочками и полосками бумаги, смазанными клейстером.
Выклейка из папье-маше моделей топографического рельефа
Для примера опишем выклейку модели возвышенности с двумя вершинами и седловиной. Сначала на бумаге вычерчивают контуры возвышенности (вид на возвышенность сверху) с обозначением горизонталей (а), то есть линий, соединяющих точки с одинаковой высотой. На другом рисунке (б) вычерчивают вертикальное сечение рельефа, то есть вид возвышенности сбоку. В соответствии с чертежом на фанерном листе или гладкой доске лепят из глины модель возвышенности, просушивают ее и выклеивают бумагой. Если модель большая, требующая выклейки большого количества слоев, для четвертого или пятого слоя применяют марлю или в виде целого куска, или нескольких больших кусков, не допуская при укладке образования складок. После просушивания модель стараются снять в целом виде. Если- это не удается, делают продольный разрез, пересекающий обе вершины и делящий модель на две половинки, которые потом склеивают.
На окончательно просушенной модели вычерчивают горизонтали и по ним разрезают модель на части. Каждую часть укладывают на лист тонкого картона и вычерчивают контур как по нижнему, так и по верхнему краю. По контурным линиям вырезают плоскости. Эти плоскости подклеивают к соответствующим частям модели (в). Каждую часть грунтуют и раскрашивают. Применяя папье-маше, можно сделать очень хорошие рельефные карты и макеты как для учебных целей, так и для выставок.

Рис. Изготовление из папье-маше модели топографического рельефа

Отделка изделий из папье-маше
Вещи, вылепленные из папье-маше, нельзя сушить на большом жару. При слишком быстром высыхании папье-маше коробится и рвется. Сушить желательно в таких местах, где вещь сохнет постепенно с одновременным испарением влаги со всей поверхности: над батареями парового отопления, над русскими печами, в умеренно нагретых духовках с полуоткрытыми дверцами, в хорошую летнюю погоду - лучше всего на открытом воздухе.
Хорошо высушенные вещи отделывают - грунтуют, шлифуют и окрашивают.
Грунтовка и шлифовка. Из многочисленных видов грунтовок лучшая для папье-маше - левкас. Готовят его так. В металлическом сосуде смешивают 400 мл густого столярного клея, 25-30 мл натуральной олифы и 100 мл масляного лака. В другом сосуде смешивают равные части порошкообразного мела и талька. Эту смесь при беспрерывном помешивании постепенно добавляют к первой. Порошкообразных веществ добавляют столько, сколько нужно для образования консистенции теста умеренной плотности. Полученную массу кипятят, оберегая от подгорания и воспламенения. Левкас наносят на папье-маше в разогретом состоянии тонким ровным слоем, используя мягкую кисть. Застывающий левкас пришлифовывают рукой, смоченной в горячей воде. После просушивания загрунтованную поверхность шлифуют мелкозернистой шкуркой. И грунтовку и шлифовку повторяют 3-4 раза. Правильно наложенная левкасная грунтовка прочна, придает поверхности нарядный зеркальный вид, сглаживает все неровности и создает отличные условия для окраски.
Окраска. Со вкусом сделанная окраска, особенно хороший рисунок или роспись, могут преобразить вещь. Рисунки и орнаменты выполняют на папье-маше художественными масляными красками. В крайнем случае, можно пользоваться и более дешевыми малярными густотертыми или готовыми масляными красками. Густотертые краски разводят натуральной олифой. Чтобы ускорить сушку, в разведенную краску добавляют немного сиккатива. Для окраски фона используют пульверизаторы, кисти и тампоны, для росписи по фону - мягкие кисти. Покрашенную и хорошо высушенную поверхность покрывают масляным лаком. Окраска и лакировка создают не только красивый вид, но и повышают прочность.
Изготовление макетов
Макетами называют копии натуры, выполненные в уменьшенном размере. Они служат ценнейшими наглядными пособиями, позволяющими понять ряд вещей в их взаимозависимости с предельным приближением к реальной обстановке. При изготовлении макетов сочетаются обычно скульптурные работы, выклейка папье-маше и живопись.
На фанерном или деревянном планшете чертят план местности. На заднике макета пишут в карандаше эскиз рисунка. В нашем примере на макете изображены скотные дворы с загонами и подсобными помещениями, река с беретами, покрытыми кустарником, вдали виднеется лес. На планшете по чертежу лепят из глины рельеф местности. Как только глина подсохнет, рельеф выклеивают бумагой. Высохшее папье-маше снимают с глины, глину сбрасывают, планшет очищают и высушивают. Русло реки окрашивают масляной или эмалевой краской в голубой цвет и прикрывают стеклом. Остальные части рельефа укладывают на свои места, прижимая ими края стекла и приклеивая их к планшету столярным клеем.
Между собой и со стеклом все части рельефа склеивают кусочками бумаги, смазанными клейстером. Макет скотного двора вырезают из легкого дерева, раскрашивают и приклеивают к соответствующему месту поверхности. Из деревянных жердочек или проволоки сооружают изгородь загона. Из мха имитируют кустарник и крону деревьев, из тоненьких веточек создают стволы деревьев. На заднике, вырезанном из фанеры, пишут масляными красками воздух и расположенные вдали поля и лес. Поверхность из папье-маше грунтуют левкасом и раскрашивают. Песчаную часть берега реки посыпают по свежей краске мелким песком.
При изготовлении макета следует строго соблюдать пропорциональность между всеми предметама и деталями. Нарушение пропорциональности и законов перспективных изображений .может создать несуразицы, когда, например, корова будет казаться выше коровника. Рисуя на заднике пейзаж с натуры, удобно применить перспективный прибор, описанный нами на страницах

Папье-маше называют процесс изготовления различных изделий из особым образом приготовленной бумажной массы. Широкое применение папье-маше находит при изготовлении наглядных учебных пособий, игрушек, художественных поделок.







Рис. 78. Папье-маше: 1 - гриб;

Существуют два способа приготовления изделий из папье-маше. Первый способ заключается в том, что из кусочков бумаги на заранее вылепленной из глины или пластилина форме выклеивают бумажную копию; которую затем сушат, грунтуют, красят и, если требуется, покрывают лаком.
По второму способу изделия формуют из пластической бумажной массы. Бумажное волокно в чистом виде мало пластично, при сушке подвергается усадке, в результате чего изделие деформируется. Чтобы масса была пластичной, хорошо формовалась и не деформировалась во время сушки, в нее добавляют так называемые наполнители: мел, глину, каолин, золу и другие вещества. Для связи составляющих массу компонентов применяют клеящие составы: раствор столярного клея, клейстер из крахмала или мучной пыли, декстриновый клей.
Глина в производстве изделий из папье-маше служит и наполнителем в составе пластических масс и материалом для изготовления форм. Поэтому она должна быть пластичной, хорошо отмученной, тщательно очищенной от сора и других примесей. Мел также используют двояко: в качестве наполнителя и как составную часть шпаклевки и грунта. Для этих целей наиболее пригоден плавленый мел, образующий при замачивании в воде жирную сметанообразную массу.
Готовые изделия из папье-маше расписывают масляными красками, гуашью, эмалевыми красителями. При изготовлении наглядных учебных пособий, муляжей, макетов пользуются всевозможными вспомогательными материалами: ватой, крашеными опилками, мхом, веточками и т. д.
При изготовлении разнообразных изделий из папье-маше используют в основном то же оборудование, что и при картонажных работах и лепке из глины и пластилина: различные кисти для клея и красок, стеки, клееварки, чашки. При работе с бумажной пластической массой требуется дополнительное оборудование: металлические или пластмассовые терки и котелки или другие сосуды для варки бумаги с наполнителями. Гипс, применяемый для изготовления форм, разводят в резиновых чашках, из которых легко удаляются остатки схватившегося гипса. Специальные чашки можно заменять половинками резиновых мячей.
До начала работы делают рисунок будущего изделия, который рассматривают как рабочий чертеж. По нему устанавливают размеры изделия, пропорции его частей, общую форму. Во избежание ошибок в изображении моделируемого предмета следует пользоваться рисунками, фотографиями и чертежами, помещаемыми в учебниках, методических пособиях, журналах, атласах. Особенно тщательно необходимо проверять свои эскизы при изготовлении учебных пособий.
Если макет в готовом виде будет помещен на картонной или деревянной подложке, то его нижнюю сторону не выклеивают. Поэтому и модель для такого макета формуют прямо на доске.
Необходимое количество размятой глины выкладывают на фанерной дощечке или толстом картоне и начинают лепить сначала пальцами, а потом стеками.
Для получения точных копий, например при изготовлении муляжей плодов и овощей, лепку из папье-маше производят в негативных гипсовых формах, отлитых по натуральным объектам. Хороший формовочный гипс полностью затвердевает через 20 мин после замешивания его водой. Перед отливкой формы модель или натуральный объект тщательно изучают и затем делят на две части с таким расчетом, чтобы в дальнейшем каждая половинка легко снималась с модели. На середине модели делают из глины выступающую часть, которую затем смазывают эмульсией из масла и мыльного порошка. Смазка предупреждает прилипание гипса к поверхности модели. В резиновую чашку наливают воду и насыпают гипс примерно в равном с водой объеме и быстро тщательно перемешивают. Полученной кашицей обмазывают модель слоем, толщина которого должна быть не менее 20-30 мм. После затвердевания модель вынимают из гипса. В бортах ее делают два-три углубления, располагая их ассиметрично. При отливке второй половинки против углублений образуются выступы, фиксирующие правильное положение частей формы. Вторая половинка отливается таким же образом. После затвердевания гипса форму раскрывают и вынимают модель. Готовую форму высушивают.
Изделия сложной формы после просушки разрезают на части, выбивают глину, соединяют вместе и наклеивают еще два слоя бумаги. Последний слой должен быть из обрывков тонкой светлой бумаги. После просушки слепок грунтуют смесью зубного порошка (мела), олифы и столярного клея. Когда грунтовка высохнет, изделие зачищают мелкозернистой шкуркой и раскрашивают акварельными красками или гуашью. При изготовлении из папье-маше рельефов земной поверхности слепок не разрезают. Глину выбивают снизу, и высохший слепок наклеивают на кусок фанеры или толстый картон.

Работа с гипсом.




Лепим из пластики
По внешнему виду пластика похожа на обычный с детства всем знакомый пластилин. С одним отличием – при термообработке (обжиге в духовке) она затвердевает и превращается в пластмассу. А значит, наиболее удачные поделки вашего чада вы сможете сохранить на память или в подарок бабушкам.
Разнообразие поделок из этого замечательного материала ограничено только вашей фантазией: разнообразные украшения, брелоки, значки, фигурки, изображающие героев любимых сказок и многое другое.
Коробочку пластики удобно иметь при себе хоть в поездках в гости, хоть на дачу. И когда случаются моменты всеобщей скуки в жарких полдень либо, наоборот, дождливым вечером, можно занять детей творчеством.
Пластики в магазинах для творчества представлено великое множество. В данном случае мы воспользовались самым простым и недорогим вариантом: коробочкой отечественной пластики от «Невской палитры». Из зарубежных фирм самая популярная пластика фирмы «Fimo». Мастера изготавливают из нее потрясающие куклы – настоящие произведения искусства.
Основные правила работы с пластикой:
- По большому счету работать с пластикой, так же как и с пластилином. Единственное, стоит отметить, что поначалу разминается довольно туго. Но пластика чувствительна к теплу рук и быстро размягчается. Если ваши детки еще совсем маленькие, у них может не хватить на это сил. Зато когда необходимый кусочек уже размят лепить из нее одно удовольствие. Кстати в ассортименте пластики «Fimo» есть специальная разновидность мягкой пластики, которая идеально подходит для детского творчества.
- Для изготовления различных изделий вам могут потребоваться: доска для лепки, какой-нибудь валик для раскатки (можно воспользоваться обычной небольшой банкой). Так же пластику легко можно резать ножницами, а если вы взялись изготавливать бусы, то для изготовления отверстий понадобится спица. Так же спицей можно наносить различные рельефы на поделку, например, нарисовать шерсть на медвежонке.
- Из дополнительных материалов очень советую достать из закромов различную тесьму, шпагат, бисер, стразы. Перед тем, как запекать бусины сделайте в них отверстия и проверьте, проходит ли в него заготовленная тесьма. Из пластики вы можете сделать даже оригинальные серьги, если вы подыщите заранее подходящие застежки.
- С помощью различных материалов можно оставлять оттиски на поделках из пластики. Здесь в ход идет все: и ткани грубых текстур, различные сетки, растения.
- Самая ответственная часть при работе с пластикой – это обжиг поделок. Лучше всего сделать пробный обжиг на каком-то кусочке, по размерам похожим на ваше изделие. Термообработка проводится в обычной духовке (микроволновая печь для этого не годится). Время запекания варьируется в зависимости от размера изделия: от 3-5 минут для мелких поделок или 5-10 для более крупных фигурок. Рекомендуемая температура в духовке 130 градусов Цельсия. При повышении температуры пластик начинает подгорать.
- Если вы лепите высокие фигурки человечков или животных, то внутрь фигурки лучше вставить проволочный каркас – это придаст ей дополнительную жесткость и защитит от опрокидывания во время запекания. Прежде чем вынуть фигурку из духового шкафа дождитесь ее полного остывания.
- После того, как вы успешно завершили обжиг изделий, вы можете рисовать на них различные узоры, черты лица и пр. Лучше всего для этого использовать акриловые краски. Если вы используете гуашь, то поверх нее придется наносить водостойкое покрытие лаком.


















Тема. Цитологический рисунок. Измерение объектов под микроскопом.
Цель работы: ознакомиться с устройством рисовального аппарата, окуляра и объект-микрометра.
Материал и оборудование: микроскопы, рисовальный аппарат РА-4, окуляр и объект-микрометр, материал для исследований, осветители ОИ-9М, ОИ-34.
Ход работы
1. Зарисовка препаратов
Зарисовка препаратов является необходимым моментом любого цитогенетического исследования. Как рисунок, так и фотография представляют документ, подтверждающий и иллюстрирующий полученные данные. Здесь мы остановимся лишь на зарисовке.
При зарисовке чаще всего пользуются рисовальным аппаратом Аббе. Основной частью этого прибора является призма, которая укрепляется на тубусе микроскопа. С помощью стержня призма соединена с зеркалом. Лучи света, проходящие из окуляра, попадают на посеребренную поверхность, грань которой расположена по отношению к лучам под углом 45°. На зеркальной грани находится узкая прозрачная полоса, через которую часть лучей попадает в глаз исследователя и дает изображение объекта (рис. 4).
Рядом с микроскопом располагают лист бумаги. Над ним находится зеркало, расположенное под углом 45° по отношению к бумаге и к зеркальной призме рисовального аппарата. Лучи, отраженные бумагой, преломляются зеркалом на 90°, попадают на призму и, еще преломляясь на 90°, попадают к глазу наблюдателя. В результате исследователь одновременно видит объект и бумагу, на которой он будет делать рисунок. Остается только остро отточенным карандашом обвести контуры объекта. При этом кончик карандаша и объект должны быть одновременно четко видны. Если объект освещен сильнее, то карандаш плохо виден или совсем не виден. Если слишком сильно освещена бумага, то виден карандаш, но не виден объект. Нужно добиться такого освещения, когда хорошо видны и кончик карандаша и объект. Первое достигается изменением освещенности бумаги за счет приближения или удаления лампы. Изменение освещенности объекта достигается регулировкой силы тока осветителя или с помощью фильтров рисовального аппарата, которые помещаются между окуляром микроскопа и призмой.
Для получения изображения, соответствующего линейному увеличению при данном объективе и окуляре, необходимо делать рисунок на уровне столика микроскопа.
2. Измерение объектов
Величина объектов - клеток, хромосом - измеряется единицами длины -микрометрами (мкм). Кроме абсолютной величины объектов в цитологических исследованиях используется показатель «линейное увеличение» - отношение величины изображенного на рисунке объема, выраженной в единицах длины, к абсолютной величине объекта, выраженной в тех же единицах.
Определение абсолютной величины объекта и его линейного увеличения проводят с помощью объект-микрометра и рисовального аппарата.
Объект-микрометр представляет собой пластинку с нанесенным на ней кругом, в центре которого имеется шкала длиной 1 мм с делениями. Цена одного деления объект-микрометра дана на пластинке (рис. 5).
13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415
Рис. 5. Объективный (слева) и окулярный (справа) микрометры

На листе бумаги с помощью рисовального аппарата наносят изображение шкалы и получают масштаб, одно деление которого соответствует цене деления объект-микрометра. Этим масштабом можно пользоваться как линейкой при измерении объектов, изображенных с помощью рисовального аппарата. Измерение можно проводить лишь при том же увеличении микроскопа, при котором было получено изображение шкалы. В случае замены объектива или окуляра другим необходимо получить новую шкалу.
При установлении линейного увеличения объекта величину объекта, полученную при помощи рисовального аппарата и выраженную в единицах длины, делят на его абсолютную величину, определенную объект-микрометром и выраженную в тех же единицах. Например, получаем изображение клетки, величина которой на рисунке 1,2 см. При измерении с помощью масштабной линейки длина её равняется 8 делениям, т.е. 80 мкм при цене деления 10 мкм. В данном случае линейное увеличение объекта получим при делении 1,2/80 мкм, т.е. равное 15.
Определение величины объекта можно проводить с помощью окуляр-микрометра (рис. 5). Окуляр-микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, которая вставляется в окуляр микроскопа. На пластинке окуляр-микрометра, как и на объект-микрометре, находится шкала. Для измерения объектов необходимо определить цену одного деления окуляр-микрометра. Для этого вместо препарата берут объект-микрометр, где известна цена одного деления, и определяют цену деления окуляр-микрометра при данном увеличении. Для этого добиваются совпадения шкал окуляр - и объект-микрометров, затем отсчитывают число делений окуляр-микрометра, точно совпадающих с каким-то числом делений объект-микрометра. Разделив абсолютное значение этого участка шкалы объект-микрометра на число делений окуляр-микрометра, получаем цену деления. Например, если совпадают 9 делений объект-микрометра и 15 делений окуляр-микрометра, то расчет проводят следующим образом. Длина участка объект-микрометра равна 10 мкм х 9=90 мкм (при цене деления 10 мкм). Цена одного деления окуляр-микрометра в этом случае равна 90 мкм: 15, т.е. 6 мкм. После этого объект-микрометр заменяют препаратом и проводят измерения необходимых объектов. При замене объектива или окуляра необходимо заново определять цену деления окуляр-микрометра.
Для измерения площади отдельных клеток или тканей на листе бумаги зарисовывают контуры клеток или определенного участка ткани. Затем зарисовывают участок величиной в 1 см2, вырезают его, взвешивают и вес принимают за 1. С весом этого участка сопоставляют веса отдельных клеток. Этот метод дает неплохие результаты, он довольно прост и точен.
Задание. Установив на столе микроскоп МБИ-3 или МБР-1, добиться рационального освещения препарата по Келлеру, подобрав необходимые светофильтры. Далее, воспользовавшись измерительным окуляром и объект-микрометром, провести определение цены деления окуляр-микрометра и записать результаты в таблицу.
Задачи и техника биологического рисунка
На практических занятиях по зоологии всегда важная роль отводится рисунку.
Как учебное средство, рисунок развивает умение наблюдать объект, выделять существенные его черты и в то же время подмечать детали. Изображение объекта и выполнение подписей к рисунку способствуют прочному усвоению знаний о строении объекта.
Научная роль рисунка сводится к тому, что он служит иллюстрацией к таксономическому или морфологическому описанию (так, не сопровождающееся иллюстрацией описание нового вида считается недействительным).
Казалось бы, в этом качестве предпочтительнее фотография - тем более что в последнее время техника фотографирования вместе с компьютерными технологиями позволяет получать качественные фотографии практически любых зоологических объектов. Тем не менее рисунок сохраняет (и будет, видимо, всегда сохранять) свою роль в научном исследовании.
Преимущество рисунка состоит прежде всего в том, что он позволяет создать обобщенный образ объекта и выделить его существенные черты, отказавшись от второстепенных деталей. Кроме того, рисунок позволяет отразить на одном изображении детали строения, которые на одной фотографии показаны быть не могут (например, потому, что не попадают в плоскость изображения и получаются размытыми). Отметим, что умение фотографировать объекты также очень важно для исследовательской работы.
Советы преподавателю
Используя рисунок как средство обучения, преподаватель должен руководствоваться следующими соображениями.
Начинать ученик должен с более простых объектов. Как правило, это объекты макроскопические (например, среди беспозвоночных это раковины моллюсков или крупные ракообразные), так как использование оптики само по себе составляет трудности для начинающего (объекты давятся покровным стеклом, пропадают из поля зрения, высыхают). Движущееся животное, естественно, рисовать сложнее, поэтому работать нужно с фиксированным материалом.
Так как главное затруднение бывает связано с верной передачей пропорций, сначала следует отработать именно это умение. Поэтому первые рисунки могут быть контурными, без передачи большого количества деталей и объемности. В то же время нужно с самого начала обращать внимание учеников на детали, предупреждая обычную склонность к излишней схематизации.
Выполнение рисунка начинающими требует постоянных консультаций преподавателя: исправить законченную работу гораздо труднее, чем внести исправления по ходу дела. Это нужно объяснить ученикам, чтобы они сами вовремя обращались за консультацией. Преподаватель может показать технику изображения на чистом листе, а при необходимости вносить небольшие исправления в рисунок ученика (не выполняя при этом за него всю работу).
Очень важно, чтобы работа над рисунком и ее результаты доставляли ученику удовольствие. Поэтому при работе со школьниками нужно уметь определить тот предел, когда новые «придирки» к данному рисунку данного ученика уже не приведут к его улучшению (этот предел может быть связан с потолком изобразительных способностей, усталостью, слабостью учебной мотивации). Если преподаватель чувствует, что этот предел достигнут работу следует либо принять как она есть, либо (при полной неудовлетворительности) забраковать и дать школьнику после перерыва другой объект.
Предпочтительным нам кажется давать при рисовании задание небольшого объема без ограничения времени. На изготовление одного качественного рисунка может уйти весь рабочий день и это даст гораздо больший учебный результат, чем сделанные за то же время пять рисунков, но халтурных. Однако на учебной практике рисунки служат все-таки в основном средством закрепления знаний о строении объектов; поэтому со временем объем задания можно увеличить. Реально за рабочий день (6 ч занятий) большинство школьников без потери качества могут выполнить не более 3 рисунков.
В завершение практики целесообразно дать задание сделать тщательный рисунок «зачетного объекта» в туши. На его изготовление может уйти 2–3 дня работы.
Вряд ли есть смысл ставить оценки за отдельные рисунки. Качество (а иногда и количество) выполненных рисунков можно учитывать при выставлении итоговой оценки за практику.
Советы начинающему рисовальщику
Правила научного изображения. Главное в научном рисунке - его достоверность. Поэтому основной принцип «рисую то, что вижу». Исключение составляют артефакты (двойное изображение, создаваемое микроскопом при неправильном освещении, пузырьки воздуха и другие посторонние объекты, попавшие на препарат). Достоверность рисунка состоит в соблюдении всех пропорций, в верном изображении деталей, видных при данном увеличении, в точной передаче цвета в случае цветного рисунка.
Особенное внимание следует обращать на линии как элемент графического изображения. Каждая линия на контурном рисунке что-то означает. Например, границы тела животного (или границы клеток на препарате) замкнуты. Линии, обозначающие их на рисунке, должны быть сплошными.
Большинство научных журналов в качестве иллюстраций к научным статьям принимает черно-белые изображения, выполненные в туши и пригодные для воспроизведения типографским способом. Это означает, что на рисунок не накладываются тени путем тонирования (например, размазывания карандаша): элементами рисунка могут быть только точки и линии. С помощью этих элементов показывается и объемность, когда это необходимо.
Техническое оснащение. Успех рисования во многом зависит от технического оснащения. Очень важную роль играет бумага. Для рисования лучше использовать не альбом, а отдельные листы в папке. Бумага должна быть плотной, гладкой и выдерживающей несколько стираний ластиком. Из имеющейся в продаже обычно наиболее отвечает этим требованиям бумага для черчения. Хорошего качества листы бумаги могут быть нарезаны из больших листов ватмана. У большинства сортов бумаги две стороны листа несколько различаются по фактуре: одна сторона более гладкая, другая шершавая. Рисунок следует выполнять на гладкой стороне. Обычно используются листы формата А4, но для некоторых рисунков (например, членистоногих с длинными придатками) более подходит формат АЗ.
Не менее важную роль играют карандаши. Большинство рисунков зоологического практикума выполняется простым карандашом. Карандаш должен быть средней жесткости («М» или «ТМ», по европейской системе обозначений «В» или «НВ») и обязательно остро заточенным (под углом 20–25 градусов). Подтачивать карандаш следует постоянно; многие дефекты рисунков возникают именно из-за пользования тупым карандашом. Годятся для рисования и автоматические карандаши с диаметром стержня 0,5 мм, которые в заточке не нуждаются.
Начинающему рисовальщику часто приходится пользоваться ластиком. Чтобы рисунок при этом не был безнадежно испорчен (особенно для последующего перевода его в тушь), ластик должен быть мягким (хорошо подходят доступные сейчас ластики фирмы «Коh-i-nооr»).
Часть рисунков во время практикума выполняется тушью. Подходит любая черная тушь, но лучшее качество дают специальные сорта туши для заправки рапидографов. Основной инструмент при рисовании тушью обычное перо («вставка»). К сожалению, в последнее время перья для туши почти исчезли из продажи. Для научных рисунков лучше всего подходят наиболее тонкие перья. Иногда целесообразно использовать два пера разной толщины для наружных контуров и внутренних линий.
Заменой перьям могут служить рапидографы, дающие линию определенной толщины. Достаточно иметь набор из трех таких рапидографов с толщиной линии 0,2, 0,3 и 0,4 мм. Главный их недостаток высокая цена. Худшая замена капиллярные ручки. Изображение хорошего качества могут давать лишь ручки с толщиной линии не более 0,2 мм, желательно с несмываемой тушью. С помощью роллеров (гелиевых ручек) выполнить рисунок обычно не удается.
Часть рисунков может быть выполнена также в акварели. Акварель должна быть полумягкая, в ванночках (а не в тюбиках). Желательно иметь набор красок не менее 24 цветов. Для рисования акварелью годятся только мягкие (беличьи) кисти, причем необходимо иметь кисти как минимум двух номеров тонкую (для прорисовки деталей) и более толстую (для заливки).
Очень важно позаботиться о сохранности уже выполненной работы. Рисунки следует хранить только в папке, причем не на рабочем месте, где их легко можно залить водой. Чистовые рисунки удобно хранить в прозрачной папке.
Методические и технические приемы рисования
Для получения рисунка хорошего качества важно учитывать множество факторов.
Один из главных размер изображения. Он определяется прежде всего количеством деталей, которые должны быть показаны на рисунке, и их размерами. Так, домик раковинной амебы, лишенный структуры или состоящий из песчинок, вряд ли необходимо рисовать во весь лист: обычно достаточно 1/4 листа формата А4 (на более мелком рисунке трудно будет показать реальное соотношение размеров песчинок и всего домика). А вот личинку насекомого (у которой разных деталей строения всегда хватает) обычно целесообразно изображать размером во весь лист. Обычная ошибка начинающих состоит в том, что они «мельчат», а на маленьком рисунке невозможно показать все необходимые детали.
Второй немаловажный фактор размещение рисунка на листе. Необходимо прежде всего следить за тем, чтобы изображение не вылезло за край. Это часто случается при изображении членистоногих с длинными придатками (антеннами, церками и т.п.). Более того у краев листа нужно оставлять поля не менее 1,5–2 см шириной. В то же время на листе нежелательно оставлять много пустого места. Как правило, объект располагают так, чтобы его длинная сторона располагалась вдоль длинной стороны листа (от этого правила возможны отступления, если на лист помещаются несколько рисунков). Если объект не занимает весь лист (например, из-за сильно вытянутой формы), то на свободном месте целесообразно поместить изображенные крупным планом его части. Это необходимо еще и потому, что излишнее количество деталей на изображении общего вида часто портит рисунок (хотя еще больше его портит недостаточное число деталей, то есть излишняя схематизация). Более мелкие, но важные детали часто невозможно изобразить на рисунке общего вида с соблюдением пропорций. В этом случае изображение отдельных частей тела животного просто необходимо.
Учебный рисунок всегда снабжается подписями. Для них на листе тоже нужно оставить место. Обычно указывается таксономическое положение объекта (начиная с класса или типа и заканчивая видом). Эти подписи делаются в углу рисунка (лучше для них провести линии по линейке). Кроме того, подписываются части объекта, имеющие диагностическое значение детали его строения, и т.п. Эти подписи можно делать на горизонтальных линиях, от которых проведены (по линейке) указывающие линии к соответствующим частям рисунка. Указывающие линии не должны пересекаться.
При изготовлении подписей важно учитывать, что в расположении объекта на листе для каждой группы организмов сложились определенные традиции. Так, большинство беспозвоночных, как правило, размещаются передним концом тела вверх, если изображаются со спинной или брюшной стороны тела, и передним концом направо, если они изображены сбоку (ветвистоусых ракообразных семейств Daphniidае и Sididae принято изображать передним концом тела вверх и при виде сбоку).
Если подписей много, их можно заменить цифрами. В этом случае в нижнем углу рисунка составляется «легенда», в которой цифры расшифровываются. Делать подписи на обратной стороне листа нецелесообразно; однако там могут быть записаны какие-то сведения об объекте, если они нужны для исследовательских целей. На обороте следует также подписать рисунок и указать дату его выполнения. Все подписи к любому рисунку (в том числе тушевому) нужно выполнять только простым карандашом, чтобы можно было при необходимости внести исправления.
Начинать рисунок следует с общего наброска. На нем должны быть прорисованы внешние контуры объекта и намечены пропорции между основный частями тела. При изготовлении наброска и при проработке рисунка до завершающей стадии все линии должны быть очень тонкими, рисовать нужно без всякого нажима на карандаш ведь изображение почти наверняка придется многократно стирать для исправлений. Карандашный рисунок практически всегда предшествует и чистовому рисунку тушью, поэтому все карандашные линии предстоит удалить. В этом случае особенно важно рисовать так, чтобы его можно было стереть, не испортив бумагу.
Правильное отображение пропорций одна из наиболее сложных задач для начинающего. При изображении макроскопических обектов (например, раковин моллюсков) можно измерить пропорции (соотношение длины и высоты раковины и т.п.) линейкой затем сделать на рисунке разметку, а по ней рисовать контуры объекта. При изображении микроскопических объектов с использованием микроскопа или бинокуляра чаще всего приходится использовать глазомер. Полезный прием определение соотношений частей тела (например, усики длиннее груди, но не достигают конца брюшка; грудь в наиболее широком месте примерно вдвое шире головы и т.п.).
Заметно облегчает задачу соблюдения пропорций использование окуляров с мерной линейкой или сеточкой (последние имеются в наборе многих бинокулярных луп). В этом случае пропорции объекта можно измерить, а на рисунке проверить их с помощью линейки. При наличии окуляра с сеточкой может применяться рисование «по клеточкам». В этом случае на лист наносится (очень тонкими линиями!) разметка в виде клеточек с помощью линейки, а затем контуры объекта врисовываются по разметке.
Лишь после того, как общие пропорции намечены, можно приступать к прорисовке деталей. При этом часто бывает полезно сменить увеличение микроскопа или бинокуляра на большее, чтобы детали были лучше различимы.
Завершающая стадия работы над рисунком, если он выполняется карандашом, придание линиям разной толщины и нанесение точечной или линейной штриховки (если она необходима). Перед этим все лишнии линии нужно стереть. линиями большей толщины и четкости обводятся внешние контуры рисунка (слишком сильно нажимать на карандаш не нужно!).
При рисовании тушью главная сложность невозможность исправить проведенную линию. Поэтому для рисунка тушью делается карандашный набросок, который затем «переводится в тушь». При этом карандашом наносятся все контурные линии, но как можно более слабые. Ластиком нужно пользоваться как можно реже: на разлохмаченной бумаге тушь расплывется, и рисунок будет испорчен.
Линии на тушевом рисунке должны быть ровными, равномерной толщины. Этого трудно достичь без опоры, поэтому рука с пером опирается на стол. Необходимая твердость руки достигается только с опытом, но важную роль играет и техническая сторона. На перо нужно набирать небольшое количество туши, иначе легко посадить кляксу (вообще тушь почему-то легко проливается на рисунки и столы, поэтому лучше не держать открытым весь пузырек, а отлить немного туши в маленькую чашку Петри или другой маленький устойчивый сосуд). Перо должно быть чистым: прилипший к нему волосок может вызвать расплывание туши. Поэтому после каждого обмакивания в тушь перо необходимо протирать чистой тканью. Чтобы перо хорошо прочерчивало линию, им необходимо провести 1–2 пробных линии на черновике (бумаге того же сорта, что используется для рисования). Толщина линии регулируется изменением нажима и угла наклона пера. Для черных частей рисунка (например, глазных пятен) может использоваться заливка с помощью тонкой кисточки или сплошной линейной штриховки пером.
При изготовлении научных рисунков микроскопических объектов обычно используется рисовальный аппарат. Современный рисовальный аппарат (типа РА-6) привинчивается под тубус микроскопа. Он позволяет видеть одновременно объект в поле зрения микроскопа и лист бумаги, на котором рисовальщик карандашом обводит контуры объекта. С помощью встроенных в рисовальный аппарат колец осуществляется наводка на резкость и регулируется размер изображения.
Применение рисовального аппарата позволяет, как правило, сделать лишь набросок объекта: для проработки де-талей рисовальный аппарат снимается с микроскопа. Однако это позволяет наиболее правильно отразить пропорции объекта и экономит (при наличии опыта) много времени.
Для успешного использования рисовального аппарата очень важно наладить освещение. Лист бумаги должен быть освещен достаточно яркой лампой; освещение же объекта (на малом увеличении), как правило, приходится уменьшать, чтобы кончик карандаша был хорошо виден на фоне изображения.
Второе условие неподвижность листа бумаги и микроскопа. Если лист бумаги сдвинулся, аккуратно совместить начатое изображение с контурами объекта сложно, и часто рисунок приходится выполнять заново. Лист можно приклеить скотчем к поверхности стола (если стол деревянный и его не очень жалко, лучше прикрепить кнопками).
С помощью рисовального аппарата легко одновременно с объектом зарисовать деления шкалы окуляр-микрометра и, зная цену деления, показать на рисунке масштабную линейку.
Использовать рисовальный аппарат есть смысл лишь после того, как освоены общие навыки рисования «на глаз».
Работа с рисовальным аппаратом
Для подтверждения точности наблюдений в ходе исследования используют либо микрофотографию, либо зарисовку при помощи рисовального аппарата, позволяющего увидеть одновременно изображение объекта и лист бумаги с карандашом благодаря имеющейся в аппарате призме-кубику.
Рисовальный аппарат РА-4 (рис. 1) состоит из призмы-кубика Аббе, помещенной в откидной оправе, зеркала на штанге, двух наборов сменных дымчатых светофильтров (один из них находится в секторе, а другой - в барабане) и хомутика.

Рис. 1. Рисовальные аппараты:
РА-4 (А): 1 - хомутик; 2 - сектор со светофильтрами; 3 - откидная оправа с призмой-кубиком; 4 - штанга; 5 - зеркало; рисовально-проекционный аппарат.
РА-6 (б); 1 - кольцо для изменения увеличения; 2 - кольцо для фокусировки карандаша; 3 - кольцо для перехода от изображения на экран к зарисовке и обратно; 4 - головка с зеркалом.

Аппарат РА-4 устанавливают на микроскоп в следующей последовательности:
1. Устанавливают свети фокусируют препарат.
2. Вынимают из тубуса окуляр и закрепляют рисовальный аппарат хомутиком. Вставляют окуляр на место, при этом откидная оправа аппарата должна лечь на окуляр. Зеркало устанавливают под углом 45° к штанге.
3. Если микроскоп имеет наклонный тубус, для зарисовки используют наклонный столик, расположенный так, чтобы его поверхность была перпендикулярна оси тубуса. При прямом тубусе плоскость бумаги должна быть параллельна поверхности стола.
4. Чтобы увидеть одновременно изображение объекта, бумагу и конец карандаша, нужно уравнять их освещенность. Яркость изображения объекта регулируют реостатом осветителя и набором сменных дымчатых светофильтров на секторе аппарата. Второй набор светофильтров, имеющийся на барабане аппарата, применяют для регулирования яркости изображения карандаша.
При помощи рисовального аппарата обводят карандашом на бумаге контуры изображения деталей препарата. Сначала лучше выполнить контурные рисунки простых объектов, например пыльцевых зерен, устьичных клеток, а затем, более сложных, например хромосом. При зарисовке сложных объектов можно воспользоваться сетчатым окуляром-микрометром. Сетку наносят на бумагу и в каждом ее квадрате обводят карандашом контуры определенных деталей микроскопического изображения.
Когда контурный рисунок готов, снимают препарат и на его место ставят объект-микрометр, чтобы сразу определить увеличение рисунка. Шкалу объекта-микрометра наносят на бумагу с рисунком. Например, 10 делений объекта-микрометра, по 0,01 мм каждое, занимают на бумаге отрезок длиной 90 мм. Отсюда нетрудно определить увеличение рисунка, оно равно 90: (0,01 10) =900.
К качеству рисунка необходимо относиться серьезно, так как рисунок не только фиксирует результаты наблюдения, некоторые авторы справедливо рассматривают его как метод исследования. Поэтому контурный рисунок неоднократно сверяют с препаратом, дополнительно вносят все мелкие детали, а потом готовят полноценный рисунок, взяв за основу для передачи изображения черту и точку.
Модель рисовально-проекционного аппарата РА-6 показана на рисунке 1. Этот аппарат применяют для зарисовки и проектирования изображения на экран. Так же, как в РА-4, здесь можно видеть одновременно препарат, лист бумаги и конец карандаша во время зарисовки. Включением другой призмы при помощи кольца 3 можно быстро спроецировать объект на экран. Устанавливают РА-6 между тубусодержателем и тубусом микроскопом
Измерение объектов под микроскопом
В практике цитоэмбриологических исследований нередко измеряют пыльцевые зерна, замыкающие клетки устьиц, хромосомы, пыльцевые трубки, зародыши и т. д. Измерения под микроскопом проводят при помощи шкалы окуляра-микрометра (рис. 2). Чтобы перевести результаты полученных измерений в микрометры, т. е. установить истинные размеры объекта, необходим объект-микрометр. Окуляр-микрометр может входить в комплект микроскопа вместе с окуляром или приобретается отдельно. Он представляет собой круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена линейка со 100 делениями.
Окуляр-микрометр вставляют в окуляр. На столик микроскопа кладут препарат и, глядя в окуляр, перемещают объект препаратоводителем, а линейку микрометра - поворотом окуляра так, чтобы можно было измерить объект в делениях окуляра-микрометра. Одновременно записывают марку микроскопа и увеличения объектива и окуляра.
Измерив необходимое число объектов, препарат снимают и на столик микроскопа помещают объект-микрометр ОМП (для работы в проходящем свете), шкала которого имеет 100 делений (рис.2). Общая длина ее 1 мм, размер одного деления - 10. мкм. Шкалу объекта-микрометра совмещают со шкалой окуляра-микрометра, используя ту же самую комбинацию окуляра и объектива, которую применяли для измерения объектов. Удобнее всего совместить сначала нулевые точки шкалы. Например, при малом увеличении 100 делений объекта-микрометра, т. е. вся шкала, совпали с 80 делениями окуляра-микрометра.

Рис. 2. Шкалы окуляра-микрометра (А) и объекта-микрометра (Б).


Рис. 3. Окулярный винтовой микрометр МОВ-1-15:
1 - окуляр; 2 - корпус; 3 - барабан; 4 - основание; 5 - винт хомутика; 6 - биштрих.

Цену одного деления окуляра-микрометра вычисляют по формуле:
Ax10
Б
где А - число делений объекта-микрометра; Б - число делений окуляра-микрометра; 10 - длина одного деления объекта-микрометра, мкм.
Подставив цифры в формулу, получим:
101х100 = 12,5 мкм
80
Это и есть цена деления окуляра-микрометра. Для получения истинного размера объекта необходимо умножить его длину или ширину, измеренную в делениях окуляра-микрометра на цену деления окуляра-микрометра в микрометрах. Например, диаметр пыльцевых зерен кукурузы составил 8 делений окуляра-микрометра. Следовательно, истинный диаметр пыльцевых зерен в микрометрах составит: 8-12,5= 100.
Цена деления окуляра-микрометра, вычисленная для малого увеличения микроскопа, не годится для работы с большим увеличением. Поэтому перед началом измерений необходимо установить цену деления для всех комбинаций объективов и окуляров.
В тех случаях, когда требуется определить площадь или - подсчитать число клеток в единице площади, в окуляр микроскопа помещают сетчатый окуляр-микрометр. Он представляет собой квадрат со стороной 10 мм, каждая из которых разделена линиями на 20 частей. Интервал между двумя линиями равен 0,5 мм.
Измерение сравнительно крупных объектов можно провести при помощи окулярного винтового микрометра МОВ-1-15 (рис. 3). Он состоит из окуляра с увеличением 15Х, основания с хомутиком, надеваемого на тубус микроскопа, отсчетного приспособления с микрометрическим винтом и отсчетного барабана. В плоскости окуляра находятся неподвижная шкала с восемью делениями по 1 мм, подвижное перекрестие и индекс в виде биштриха. Отсчет проводят по шкале (в миллиметрах) и барабану (в сотых долях миллиметра).
До измерения объекта определяют увеличение объектива микроскопа. Для этого на столик микроскопа помещают объект-микрометр, на тубус надевают винтовой окулярный микрометр и фокусируют на резкость изображения перекрестия и шкалы объект-микрометра. Биштрих устанавливают в начале или в конце шкалы. Берут некоторое число делений объекта-микрометра, например 25. Подводят перекрестие к первому штриху шкалы и снимают отсчет, затем подводят перекрестие к двадцать пятому штриху и снова делают отсчет.
Линейное увеличение объектива определяют по формуле
V = M-N
ab
где V - увеличение объектива; М-N - разность двух отсчетов; а - число делений объекта-микрометра; b - цена деления объекта-микрометра.
Для измерения объекта на столик микроскопа помещают препарат, центр перекрестия совмещают с краем изображения объекта и делают отсчет. Затем перекрестие совмещают со вторым краем объекта и снова делают отсчет.
Размеры объекта определяют по формуле
C = M-N
V
где С - длина или ширина объекта, мм; V - увеличение объектива; М-N - разность отсчетов.

СПОСОБЫ ПОДГОТОВКИ К ИССЛЕДОВАНИЮ
И МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ
Рассмотрим методы исследования, при помощи которых накапливают данные о строении, функции, химическом составе клетки и ее структурных компонентов. К ним относятся: прижизненные наблюдения, изучение фиксированных и окрашенных клеток и тканей, высушенных замороженных (лиофилизированиых) объектов, цитохимия, дифференциальное центрифугирование, авторадиография, культура клеток и тканей, микрургия и др.
Почти каждый из перечисленных методов исследования непременно сопряжен с одним или несколькими методами наблюдения. Исследователь для получения информации о протекающих процессах на уровне клетки должен быть хорошо знаком с разными способами исследования клетки, которые неравноценны между собой, и каждый имеет свои достоинства и недостатки.
Прижизненные наблюдения объектов очень распространены в цитофизиологии. Пыльцевые зерна, пыльцевые трубки, рыльца, столбики, волоски тычиночных нитей нередко для изучения морфологии клетки, прижизненной кислотности, окислительно-восстановительного потенциала, степени дисперсности коллоидов протопласта, жизнеспособности, проницаемости и т.д. приходится смотреть под микроскопом в капле жидкости. Метод используют при просмотре искусственных культур клеток растений, грибов, бактерий. Вследствие низких показателей преломления содержимого живой клетки прижизненные наблюдения часто проводят на темном поле, в фазовом контрасте, поляризованном свете, флуоресцентным методом.
Препараты с живыми объектами недолговечны, а использование при работе с ними красителей ограничено вследствие их токсичности. Такие красители, как янус зеленый, нейтральный красный, метиленовый синий и другие, применяют для окрашивания живых объектов в слабой концентрации (от 10-4 до 10-5) и обрабатывают ими ткани всего несколько минут. Специальные красители – флуорохромы – применяют для изучения живых объектов в люминесцентном микроскопе. Для прижизненных наблюдений используют следующие среды: воду, р-р сахарозы, вазелиновое, парафиновое, силиконовые (ВИЖ-94а, полисилаксан) масла и др.
В 1970 г. И.Д. Романов наблюдал движение цитоплазмы, сочетая прижизненные наблюдения с методом фазового контраста. Таким образом, он исследовал пыльцевые зерна пшеницы, ржи, овса от момента обособления пыльцевых зерен до образования крахмала, что совпадает с периодом спермиогенеза, используя в качестве среды 5%-ный раствор сахарозы.
Фиксация с последующим окрашиванием клеток и тканей – один из наиболее распространенных способов подготовки объектов к исследованию в цитологии и эмбриологии. Под действием химических фиксаторов (этиловый спирт, формалин, уксусная кислота и др.) в клетке прекращаются жизненные процессы, а ее химические компоненты осаждаются. После фиксации объект промывают. Дальнейшая обработка зависит от типа приготовления препарата. Можно окрасить материал сразу для изготовления временного препарата. Для получения тонких срезов толщиной в несколько микрометров объект обезвоживают, заключают в парафин и режут на микротоме. Срезы наклеивают на предметные стекла, освобождают от парафина и окрашивают. Красители подбирают так, чтобы повысить контрастность изображения отдельных структур, а в ряде случаев и выявить их химический состав, например ДНК, РНК, белки и др. Точное содержание химических веществ определяют на приборе – цитофотометре.
При цитохимических исследованиях приходится считаться с тем, что химические фиксаторы могут вызывать артефакты, т. е. изменения в клетках, вызванные тем или иным фактором. Чтобы избежать этого, используют метод высушивания замороженных объектов, в процессе которого химические компоненты клетки не осаждаются. Кусочки ткани толщиной около 0,1-1 мм и площадью 1 мм2 замораживают в изопентане, охлаждаемом жидким азотом до минус 170 °С. Замороженный объект переносят в сушильный аппарат, где при низкой температуре (минус 30-40 °С) в вакууме из него удаляют воду. Высушенный материал затем готовят для микроскопического исследования. В нем хорошо сохраняются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, некоторые полисахариды и другие соединения и не происходит нежелательного перераспределения вещества.
Дифференциальное центрифугирование применяют для изучения химического состава ядер, митохондрий и других структур. В этом случае объект измельчают с использованием сахарозы в специальном приборе – гомогенизаторе. Полученный гомогенат путем дробного центрифугирования разделяют по плотности на фракции, состоящие из определенных, но изолированных клеточных структур. При сравнительно небольших ускорениях на центрифуге из гомогеиата осаждают клеточные ядра. При значительно больших ускорениях центрифугированием надосадочной жидкости выделяют митохондрии, а затем рибосомы и другие структуры.
Метод авторадиографии применяют для изучения локализации и синтеза нуклеиновых кислот в клеточных структурах с использованием меченых соединений и определения продолжительности митотического цикла. При работе этим методом используют изотопы, при распаде которых образуются электроны с малым запасом энергии.
Для регистрации
·- и
·-излучений необходимы специальные фотоэмульсии, при контакте которых с меченым объектом на них остаются следы электронов. Так изотоп подает сигнал о своем местонахождении, и это позволяет проследить движение, перераспределение и превращения определенных веществ клетки. Разработаны способы количественного анализа радиоавтографов, что расширяет возможности метода.
Метод культуры клеток и тканей используют при подготовке к исследованию живых клеток в условиях, благоприятных для их жизнедеятельности и размножения. Небольшие кусочки тканей, органы или отдельные клетки можно культивировать в стерильных условиях на питательной среде in vitro при оптимальной для них температуре. Культуру периодически переносят в свежую питательную среду для длительного сохранения жизнеспособности. Однослойные культуры клеток удобны для прижизненных наблюдений методом фазового контраста и киносъемки. Так можно проследить весь жизненный цикл клеток. Из отдельных клеток можно вырастить целые растения. В последние годы интерес к этому методу возрос в связи с возможностью использовать его при изучении генетики соматических клеток: в биотехнологии – для выращивания зародышей на искусственной питательной среде, при клеточной инженерии, позволяющей получать парасексуальиые гибриды путем слияния изолированных протопластов разных видов растений и гаплоидов из клеток пыльников.
Нередко возникает необходимость вмешаться во внутренние процессы, протекающие в клетке. Это достигается при помощи тонкого метода исследования – микрургии. Она позволяет проводить трансплантацию ядер из клетки в клетку, определять прижизненную кислотность отдельных структур, измерять биотоки, температуру и т. д. Для выполнения подобных операций необходимы прибор микроманипулятор ММ-1 с микроскопом и набор стеклянных игл, пипеток, петель, электродов и т. д.
В цитологии микрургические операции проводят обычно на клеточном уровне, в эмбриологии – на зародышах или их органах. Для микрургии объект заключают в стеклянную камеру, заполненную определенной средой, и все операции выполняют под микроскопом.
В зависимости от цели и объекта исследования можно использовать один или несколько указанных выше методов. Так, в кариологии чаще работают методом фиксации с последующим окрашиванием тканей и клеток. Цитофизиологи предпочитают прижизненные наблюдения, а в цитохимии сочетают фиксацию, лиофилизацию, авторадиографию, прижизненные наблюдения, окрашивание и др.
Совокупность приемов, направленных на выявление локализации определенных веществ в тканях и клетках, получила название микроскопической гистохимии. В последние годы для изучения химии клеточных структур все чаще используют абсорбционные оптические методы, которые>в совокупности называют цитофотометрией. Она делится на ультрафиолетовую и видимую. Последняя базируется на применении специфичных красителей.
Для фотометрирования используют микрофотометрические насадки (ФМЭЛ-1, ФМЭП-1), цитофотометры (МЦФВ-1, МЦФУ-1), универсальные микроскопы-фотометры, микроспек-трофотометры. Цитофотометр состоит из микроскопа и микропроектора. Анализ препарата ведут в монохроматическом свете с длиной волны, лежащей в пределах поглощения исследуемого вещества. Методы цитофотометрии позволяют измерить содержание поглощающих веществ в клетке и ее структурах.
ПОСТОЯННЫЕ МИКРОТОМНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Исследование микротомных препаратов сыграло огромную роль в развитии цитологии и эмбриологии растений. Многие отечественные ученые, начиная с С.Г. Навашина, сделали очень ценные наблюдения на постоянных микротомных препаратах. Эти препараты являются прекрасным демонстрационным материалом и могут храниться долгие годы. На тонких срезах толщиной 10-22 мкм можно изучать митоз и мейоз, подсчитывать число хромосом, наблюдать проникновение пыльцевых трубок в зародышевый мешок, двойное оплодотворение, развитие зародыша, эндосперма и т. д.
Техника приготовления окрашенных микротомных препаратов для растений введена В.И. Беляевым. Объекты, предназначенные для таких исследований, претерпевают сложную обработку. Ниже приведена последовательность обработки исследуемого материала по Юрцеву.
Подготовка материала к фиксации.
Фиксирование материала водным (24 ч) или спиртовым фиксатором (30 мин12 ч).
Промывка фиксированного материала:
после водных фиксаторов
после спиртовых фиксаторов

в проточной воде 1-3 ч
в 3 сосудах с 80%-м р-ром этилового спирта по 1-2 ч в каждом (запах уксусной кислоты должен исчезнуть)

4. Полное обезвоживание промытого материала;

Пропитывание материала растворителями парафина (хлороформом, ксилолом или бензолом):

Пропитывание материала парафином (замещение промежуточной жидкости парафином): в хлороформ (или ксилол) добавляют парафин и эту смесь помещают в термостат при температуре 56-57 °С до полного испарения хлороформа (или ксилола) и замещения его в материале парафином в течение 3-6 сут.
Заливка материала в парафин (материал, залитый в парафин, можно хранить очень долго).
Изготовление блоков из материала, пропитанного парафином.
Получение срезов при помощи микротома.
10. Наклейка срезов на предметные стекла.
Просушивание препарата при 40-45°С (стекла со срезами можно хранить очень долго, если оберегать их от пыли и высокой температуры).
Удаление парафина, из срезов ксилолом.
Удаление ксилола из срезов спиртом.
Удаление спирта из срезов дистиллированной водой.
Окрашивание препаратов (иногда с предварительным протравливанием) и дифференцировка.
Обезвоживание окрашенных срезов 96%-м раствором и 100%-м этиловым спиртом.
Замещение спирта в срезах на ксилол (одновременно происходит осветление срезов ксилолом).
Заключение срезов в канадский бальзам.
Просушивание препаратов и подчистка.
Этикетирование препаратов.
Изучение препаратов под микроскопом.
Подбор объектов для исследования и подготовка их к фиксации
Для цитологических и эмбриологических исследований очень важно определить, какие органы и ткани растения необходимы для работы. Например, митоз можно наблюдать в меристемах молодых быстрорастущих корней растений, в главных корнях проросших семян, в конусах нарастания стебля и др. Обычно для изучения митоза и подсчета числа хромосом в соматических тканях растения предпочитают работать с молодыми корнями, так как в них непосредственно под чехликом находится зона активного деления клеток (конус нарастания корня) и фигуры деления здесь удобно ориентированы.
Для изучения мейоза и подсчета числа хромосом во время деления материнских клеток микроспор используют у растений семейства мятликовые – молодые колосья за несколько дней до выколашивания, мотыльковые и некоторые другие – небольшие бутоны до приобретения ими окраски или непосредственно молодые пыльники. Оплодотворение и различные этапы эмбриогенеза наблюдают в опыленных цветках через определенные промежутки времени после нанесения пыльцы на рыльце.
Имея необходимые объекты для исследования, нужно обратить серьезное внимание на их подготовку к фиксации. От этого во многом зависит достоверность эксперимента. Например, чтобы наблюдать деление клеток в кончиках молодых корней» очень важно обеспечить соответствующую температуру воздуха, влажность среды, а в полевых условиях – еще почвенное питание и освещение, т. е. создать оптимальные условия для нормального роста и развития растений. Отсутствие необходимых условий тормозит рост растений и деление клеток.
В специальных исследованиях иногда необходимо не только наблюдать деление клеток в конусе нарастания корня, но и определить время наступления первых митозов. Установлено, что при одной и той же температуре (23-25°С) первые митозы у проросших семян различных видов растений наблюдаются в корешках неодинаковой длины. Например, у скерды зеленой (Сrepis capitlaris (L.) Wallr.) они бывают в корешках длиной 2-3 мм, у бобов (Vicia faba L.) – 12-17, у мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) – 10-12 мм. Следовательно, при подготовке корней к фиксации следует обращать внимание на их длину.
Подмечено также, что число делящихся клеток в различные часы суток неодинаково. Это заставляет учитывать в ряде случаев, периодичность митозов и проводить фиксацию материала в разное время с определенными интервалами в зависимости от объекта.
Как указывалось выше, для изучения митоза и подсчета числа хромосом можно брать проросшие семена и растения, выращенные в вазонах или непосредственно в полевых условиях. Если семян достаточно, их проращивают в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге. Чашки Петри с семенами помещают в термостат с температурой воздуха 23-25 °С или в теплое место, например под лампу. Корни могут появиться через несколько суток, в течение которых необходимо следить за тем, чтобы фильтровальная бумага была влажной. В ряде случаев целесообразно менять температуру при проращивании семян (ночью 27°С, днем 0-2°С).
Фиксируют корни, когда длина их достигнет в зависимости от объекта 3-15 мм. Если нужно зафиксировать корни во время первых митозов, то их берут только определенной для данной культуры длины. Максимум митозов неодинаков в корнях разной длины. Так, у бобов он отмечен в корнях, достигших длины 1-1,5 см, у гороха – 1,5-2, у гречихи – 1-2, у ржи – 1,5 см и т. д. В некоторых случаях фиксируют не отдельно корни, а проросшие семена целиком, например у мелкосемянных культур – скерды зеленой, лука.
Растения, выращиваемые в небольших вазонах диаметром 10-12 см, лучше помещать на освещенное место в теплице. Почва в вазонах не должна быть плотной. Чтобы предотвратить высыхание и создать благоприятные условия для растущих корней, вазоны ставят в ящики с влажной почвой и систематически поливают. Через 2-3 недели после посева семян в вазоне на поверхности земляного кома появляются многочисленные молодые корни, которые отрезают ножницами и сразу помещают в фиксатор.
Иногда нужно зафиксировать корни растений, растущих в полевых условиях. В этом случае растения также нужно заранее подготовить, полить, удобрить навозом, подрыхлить. Подготовленные экземпляры подкапывают с одной стороны, находят молодые корни и отрезают их ножницами. Фиксировать их лучше в тени во избежание преждевременной порчи обнаженных корней на солнце.
В. ряде случаев возникает необходимость подсчитать число хромосом у растений, размножающихся луковицами, клубнями, черенками и т. д. Для этого черенки, листья, луковицы помещают в сосуд с водой или с искусственной питательной смесью} а клубни – в мокрый песок.
Для наблюдения процессов оплодотворения и формирования зародыша цветки заранее кастрируют, опыляют и фиксируют через определенные промежутки времени после нанесения пыльцы на рыльце. Для такого опыта важно обеспечить сравнимость, результатов.
Специальная обработка объектов перед фиксацией
В некоторых случаях, когда хромосом много и они длинные что затрудняет их изучение и подсчет, корни перед фиксацией обрабатывают специальными реактивами, например 8-оксихино-лином, хлоралгидратом, колхицином, парадихлорбензолом, холодом. 8-оксихинолин применяют для предварительной обработки объекта или как составную часть фиксатора. В первом случае объект помещают на 3 ч в 0,002 М. раствор 8-оксихинолина при температуре 10-14 °С и после промывки в воде фиксируют. Эту методику в основном используют для приготовления временных препаратов. Однако она была испытана и на постоянных препаратах в лаборатории цитогенетики Ботанического института имени В.Л. Комарова. Для этого 0,58 г 8-оксихинолина растворяют в 200 см3 теплой дистиллированной воды. Водный р-р реактива готовят при температуре воды около 60 °С. Оказалось, что предварительная обработка этим реактивом увеличивала толщину хромосом в 1,5 раза, не изменяя их длины. Первичные и вторичные перетяжки хромосом выступали резче. По данным. Всесоюзного НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВНИИР), требуется обработка: лука – в течение 4 ч, ячменя – 3-4, картофеля – 2-3, вики – 5 ч при комнатной температуре.
Если для укорачивания хромосом применяют хлоралгидрат, то берут водный р-р этого реактива 0,3-1%-й концентрации. Корни погружают в него на 1 ч, затем столько же времени промывают в проточной воде. После этого их помещают во влажную камеру на 2-4 ч и фиксируют.
Нередко для остановки митозов объекты перед фиксацией обрабатывают слабым р-ром колхицина. Например, корни скерды зеленой размерам 2-3 мм за 2 ч до фиксации обрабатывают этим препаратом в концентрации 0,05%. Для пшеницы и риса берут 0,1 %-й р-р колхицина и выдерживают в нем соответственно 5 и 4 ч.
Другие зерновые культуры и картофель для приостановки митозов опускают в р-р колхицина 0,01%-й концентрации. Молодые листочки можно выдерживать в 0,2%-м р-ре колхицина в течение 1-2 ч.
Для обработки корней иногда используют насыщенный р-р парадихлорбензола. Для этого 5-10 г кристаллического препарата растворяют в 500 мл дистиллированной воды и оставляют в закрытой посуде в термостате при температуре 60 °С на 10-12 ч, Материал опускают в р-р на 2-3 ч при температуре 12-16 °С, корни гороха при комнатной температуре - на 6 ч.
Для кардиологического анализа нередко действие колхицина сочетают с последующей обработкой смесью насыщенного р-ра парадихлорбензола и 0,002 М 8-оксихинолина (1:1). При исследовании пшеницы берут насыщенный р-р монобромнафталина в воде и 0,1-0,01%-й р-р колхицина, кукурузы - 0,05%-й - колхицина и 0,5%-й - монобромнафталина. Экспозиция в обоих случаях – 4 ч (общее время).
Растворы колхицина, монобромнафталина и других веществ готовят в резиновых перчатках.
Хромосомы укорачиваются также, если перед фиксацией выдерживать чашки Петри с проросшими семенами в холодильнике при температуре 1-2°С в течение суток.
При изучении морфологии хромосом иногда объекты перед фиксацией обрабатывают одним из следующих способов:
в 2%-м растворе кумарина 2 ч при температуре 12-16°С;
в смеси кумарина и 8-оксихинолина (1:1) в течение 2 ч при 16 °С.
Фиксаторы, их состав и использование
Фиксация материала, т. е. быстрое умерщвление клеток в специально подобранных растворах ядовитых реактивов, которые называются фиксаторами, прерывает тот или иной процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние.
Известно много фиксаторов, но каждый из них имеет определенное назначение. Очень важно выбрать такой фиксатор, который, убивая клетку, несильно искажает ее прижизненную структуру и отвечает целям исследования. Для цитологических и эмбриологических исследований обычно используют ядерные фиксаторы (фиксатор С. Г. Навашина, Карнуа и др.), хорошо фиксирующие ядро. Некоторые реактивы хорошо фиксируют митохондрии и пластиды (фиксатор Г. А. Левитского) и др.
Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких реактивов, каждый из которых редко используется для фиксации вследствие одностороннего действия. В состав этих смесей могут входить: ледяная уксусная кислота, хромовая кислота, формалин, хлороформ, осмиевая кислота, спирт и др.
Уксусная кислота (СН3-СООН) - бесцветная жидкость с резким запахом. Хорошо смешивается с водой, спиртом, эфиром, хлороформом. Ледяная уксусная кислота имеет 99,8% основного вещества и при охлаждении образует кристаллическую массу. Эта кислота, быстро проникая в ткани, может вызвать их набухание, хорошо осаждает нуклеиновые кислоты. Кроме того, она хорошо сохраняет форму хромосом, но разрушает митохондрии и комплекс Гольджи. Уксусная кислота входит в состав многих ядерных фиксаторов, но может использоваться и самостоятельно. В последние годы ее нередко заменяют при фиксации пропионовой кислотой (СНз-СН2-СООН), которая способствует лучшей фиксации и окрашиванию объектов.
Хромовую кислоту готовят растворением в воде хромового ангидрида СгОз - сильного окислителя, представляющего собой темноокрашенные кристаллы, очень гигроскопичные и легкорастворимые в воде. Она проникает в объекты не очень быстро, коагулирует белки, сохраняет детали строения ядра, цитоплазмы, а также митохондрии и комплекс Гольджи. После фиксации хромовой кислотой объект необходимо тщательно промыть водой, иначе образуется осадок, мешающий окрашиванию тканей.
Осмиевая кислота представляет собой раствор сильного окислителя - тетраоксида осмия (OsO4). Эта кислота медленно, а иногда и неравномерно проникает в объект. Однако она вызывает наименьшие изменения в структуре цитоплазмы и ядра. Ею можно фиксировать митохондрии, а из органических соединений - липоиды и жиры.
Формалин - водный раствор формальдегида (СН2О), примерно 40%-й. Это вещество может образовывать осадки в тканях, так как содержит в виде примеси муравьиную кислоту. Чтобы избежать их появления, необходимо пользоваться нейтральным формалином. Для этого на дно темной бутылки с его концентрированным раствором насыпают мел. Иногда нераз-веденный формалин образует белый осадок, для растворения которого бутыль ставят в термостат при температуре 54-56 °С на сутки.
Формалин используют как составную часть ядерных фиксаторов. Он сохраняет тонкую структуру цитоплазмы, митохондрий и комплекса Гольджи, фиксирует липоиды, жиры и жирные кислоты, придавая некоторую твердость тканям. После фиксации необходима тщательная промывка в воде. Подмечено, что после фиксации объектов формалином и хромовой кислотой они плохо окрашиваются кармином.
В качестве составных частей фиксаторов нередко используют различные растворители: ацетон (СН3-СОСН3), диоксан (С4Н8О2), хлороформ (СНСl3), петролейный эфир и спирты - этиловый, или этанол, - С2Н5ОН, изопропиловый, или пропанол-2,-СН3-СН(ОН)-СН3 и др. Из них наиболее часто употребляют этиловый спирт. Он осаждает нуклеиновые кислоты, альбумины, глобулины, но растворяет липоиды. Благодаря нейтральной реакции применим для гистохимических исследований. Один этанол редко используют как фиксатор, так как он вызывает искажение структур клетки, сильное сморщивание и затвердение тканей.
Все растворы фиксаторов готовят или на спирту (спиртовые фиксаторы), или на дистиллированной воде (водные фиксаторы). Спиртовые фиксаторы быстро проникают в ткани, и материал в них выдерживают от 30 мин до 12 ч. Водные фиксаторы значительно медленнее проникают в ткани, поэтому в них объекты должны находиться не менее суток, а иногда дольше. Спиртовые фиксаторы грубее по своему действию, чем водные, но они и более стойкие, их можно готовить заранее в отличие от водных.
Фиксатор выбирают в зависимости от цели и объекта исследования. На первых этапах работы можно испытать несколько видов, чтобы выбрать наиболее надежный. Мелкие бутоны и нежные корни хорошо фиксируются в водных фиксаторах, крупные бутоны и толстые корни в спиртовых. Трудносмачиваемые объекты (пыльники, почки и др.) для успешной фиксации можно обработать сначала спиртовым препаратом (несколько минут), а затем водным. Хлорофилл, сахара, жиры при фиксации обычно извлекаются из клеток, митохондрии разрушаются, поэтому не обнаруживаются при изучении объектов под микроскопом. Ниже приведен состав некоторых ядерных фиксаторов.
Фиксатор С.Г. Навашииа (10:4: 1) используют для фиксации корней (не слишком плотных и толстых) и мелких эмбриологических объектов. Продолжительность фиксации 24 ч в темноте.
Состав: хромовая кислота 1%-й раствор - 10 ч.; формалин - 16%-й - 4 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.
Фиксатор готовят перед употреблением, так как он быстро портится. Этот фиксатор относится к группе водных, он действует очень мягко и хорошо сохраняет структуру хромосом1.
Фиксатор Карнуа (6:3:1) широко используют в цитологической и эмбриологической практике для изготовления постоянных микротомных и давленых препаратов. Продолжительность фиксации от 2 до 12 ч.
Состав: абсолютный этиловый спирт или его 96%-й раствор - 6 ч.; хлороформ - 3 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.
Относится к группе спиртовых, быстро проникает почти в любые объекты, действует не так мягко, как фиксатор Навашина.
«Уксусный алкоголь», или фиксатор Кларка (3 : 1), широко применяют в цитологических и эмбриологических исследованиях, особенно для изготовления давленых препаратов. Материал выдерживают в фиксаторе от 2 до 12 ч, а иногда и хранят в нем при 0-3°С.
Состав: абсолютный этиловый спирт или его 96%-й раствор - 3 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.
Действует подобно фиксатору Карнуа. Уксусную кислоту иногда заменяют пропионовой. На основе последней разработай состав нескольких фиксаторов для растительных объектов:
пропионовая кислота - 1 ч., 96%-й раствор этилового спирта - 3 ч.;
пропионовая кислота - 100 мл, 96%-й раствор этилового спирта - 100 мл, гидроксид железа - 0,4 г (перед тем как поместить объект в этот фиксатор, на каждые 10 мл смеси добавляют несколько капель кармина);
пропионовая кислота - 1 ч., хлороформ - 4 ч., абсолютный этиловый спирт - 3 ч.;
формалин - 1 ч., 96%-й раствор этилового спирта - 15 ч., пропионовая кислота - 2 ч. (рассчитан на 1-2 ч действия и применяется для растительных и животных объектов).
Фиксатор Флемминга используют для мелких объектов.
Состав: хромовая кислота, 1%-й раствор - 25 мл; осмиевая кислота, 2%-й - 5 мл; ледяная уксусная кислота - 10 мл; вода - 60 мл.
Материал фиксируют не менее суток, а затем промывают в воде.
Фиксатор Шампи. Продолжительность фиксации 24 ч.
Состав: хромовая кислота, 1%-й раствор - 35 мл; бихромат калия, 3%-й - 35 мл; осмиевая кислота, 2%~й-15 мл; ледяная уксусная кислота – 2-4 капли.
Фиксатор Я.С. Модилевского (9:2:2:2) используют в эмбриологической практике. Продолжительность фиксации 24 н.'
Состав: хромовая кислота, 1%-й раствор - 9 ч.; формалин» 16%-й - 2 ч„; бихромат калия, 5%-й раствор - 2 ч.; уксусная кислота, 5% -й раствор - 2 ч.
Фиксатор водный, мягкого действия.
Фиксатор Чемберлена (почти универсальный) применяют для эмбриологических и анатомических исследований* особенно крупных объектов. Продолжительность фиксации 16 ч. В этом фиксаторе материал можно хранить.
Состав: этиловый спирт, 50-70%-й раствор - 90 ч.; формалин - 5 ч.; ледяная уксусная кислота - 5 ч. По действию занимает промежуточное положение между фиксаторами Карнуа и Навашина.
Фиксатор Батталья используют в цитологической практике в двух соотношениях 1 - 5:1:1:1 и 2 - 5:5:1:1 (во втором объекты можно хранить). Продолжительность обработки 5 мин.
Состав фиксатора 1 этиловый спирт, 96%-й раствор - 5 ч.; хлороформ - 1 ч.; формалин, 16%-й - 1 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.
Состав фиксатора 2: этиловый спирт, 96%-й раствор - 5 ч.; хлороформ - 5 ч.; формалин, 16%-й - 1 ч.; ледяная уксусная кислота - 1ч.
Фиксатор Ньюкомера (6:3:1:1:1) в последние годы применяют для изучения мейоза у зерновых культур на давленых препаратах. Молодые колосья фиксируют в течение суток при комнатной температуре, затем заливают свежим фиксатором и хранят в холодильнике до анализа. Пыльники окрашивают ацетокармином. Фиксатор используют и для изучения корней.
Состав: изопропиловый спирт - 6 ч.; пропионовая кислота - 3 ч.; диоксан - 1 ч.; петролейиый эфир - 1 ч.; ацетон - 1 ч.
Ледяная уксусная кислота. Продолжительность обработки 12-72 ч в условиях холодильника. После фиксации промывают 96%-ным раствором этилового спирта.
Фиксатор В. Я. Бродского, или ФСУ (3:1: 0,3). Используют для цитохимических исследований, в нем хорошо сохраняется РНК.
Состав: формалин - 3 ч.; абсолютный спирт этиловый - 1 ч, уксусная кислота - 0,3 ч.
Продолжительность обработки корней 1-1,5 ч, максимум - 6 ч. После фиксации материал необходимо промыть водой в течение 12 ч или в трех-четырех сменах 70%-го раствора этилового спирта.
Фиксатор Н. Т. Кахидзе: 100 мл 75%-го раствора этилового спирта + 5 г сахарозы. Используется для изучения рИ ИЭТ (изоэлектрическая точка).
Фиксатор Г. А. Левитского используют при изучении митохондрий. Он состоит из трех растворов, в которые последовательно помещают материал.
1-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор - 3 мл; формалин, 4%-й - 17 мл. Продолжительность фиксации - двое суток.
2-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор - 15 мл; осмиевая кислота, 2%-й - 2 мл; вода - 18 мл. Продолжительность фиксации - 6 сут.
3-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор - 15 мл; осмиевая кислота, 2%-й - 4 мл. Продолжительность фиксации - 9 сут, затем материал промывают в течение суток в воде.
Фиксатор Рего также применяют для наблюдения хромосом.
Состав: диохромат калия, 3%-й раствор - 80 мл; формалин - 20 мл.
Зафиксированный материал выдерживают в темноте четверо суток, заменяя ежедневно фиксатор свежим. Затем на 8-13 сут материал переносят в 3%-ный раствор дихромата калия, после чего в течение суток промывают в воде.
Смесь по Немецу используют для фиксации плазмодесм.
Состав: пикриновая кислота (насыщенный раствор готовят на холоде) - 100 мл; ледяная уксусная кислота - 70,5 мл; концентрированная серная кислота - 0,5 мл.
Материал фиксируют 24 ч, а затем промывают 60%-м раствором этилового спирта. Окрашивают железным гематоксилином.
Формалиновый спирт также применяют для фиксации плазмодесм.
Состав: спирт этиловый, 70%-й - 50 ч.; формалин - 10 ч. Через сутки после фиксации материал промывают 70%-м раствором этилового спирта и хранят в 96%-м его растворе.
Смесь Гаммалунда обладает хорошими консервирующими свойствами для хлоропластов.
Состав: медный купорос (концентрированный раствор) - 15 ч.; формалин - 1 ч.; вода - 5 ч. Материал выдерживают в растворе 1-2 недели, затем переносят в слабый раствор формалина (на 1 л воды 50 мл формалина).

Фиксация
При подготовке к фиксации и в процессе ее выполнения необходимо соблюдать некоторые общие правила:
подобранный фиксатор должен соответствовать цели исследования; инструменты подбирают заранее (рис.26);
объем фиксирующей жидкости должен значительно (в 50-100 раз) превышать объем материала;
фиксируют только свежие корни и бутоны, стараясь это делать на месте выращивания растений. Чтобы уберечь обнаженные корни от действия лучей солнца, лучше проводить фиксацию в тени;
крупные объекты, например корзинки сложноцветных, перед фиксацией разрезают на несколько частей, удаляя ненужные органы (листья, чашелистики, ости и т. д.), мешающие пропитыванию материала. Во время фиксации ножницами отрезают кончики корней длиной 6-7 мм и сразу помещают в фиксирующую жидкость. Бутоны чаще фиксируют целиком, колосья предварительно разбирают на колоски, но иногда соцветия также фиксируют целиком;
время фиксации в течение суток определяют в каждом конкретном случае. Корни лучше фиксировать в те часы, когда наблюдается максимум митозов.

Рис. 26. Зонд, ножницы, пинцет, скальпель.

Правильная организация всей подготовительной работы предусматривает некоторую последовательность операций, обеспечивающую сравнимость изучаемых вариантов и сокращающую до минимума потери времени на непредусмотренные мероприятия.
Рассмотрим последовательность работы при фиксации корней.
Чтобы обеспечить нормальное деление клеток в корнях, вазоны с растениями накануне и за 1-2 ч до фиксации обильно поливают и ставят в теплое место с температурой воздуха 20-25 °С. Чашки Петри с проросшими семенами держат в термостате при температуре 24-25°С. За 1-2 ч до фиксации их также поливают, чтобы корни были свежими.
Заранее готовят плоскодонные пробирки или флаконы
· из-под пенициллина с корковыми пробками и этикетки из плотной бумаги. Пробирки обычно используют с полезным объемом не менее 10 см3. При фиксации колосьев применяют плоскодонные пробирки большего объема, так чтобы в каждую из них можно было поместить несколько колосьев одного варианта. Для этикеток берут белую плотную бумагу. Пергаментная бумага и калька для этих целей не подходят. Размер этикеток 1-1,3х3,5-4 см. На них обычным карандашом аккуратно пишут номер фиксации по журналу регистрации фиксаций, дату и час обработки, название объекта (например, «корни Tritictim durum»), сокращенное название фиксатора (Ф. К. - фиксатор Карнуа). Этикетка в пробирке должна соответствовать этикетке в вазоне, в поле или чашке Петри. Особенно важно отметить вариант исследования.
В журнале регистрации фиксаций записывают те же сведения об объекте и варианте исследования, которые имеются на этикетке в вазоне, в поле или чашке Петри. Кроме того, указывают цель работы и те данные, которые будут необходимы при обработке результатов научных исследований, например вид специальной обработки корней перед фиксацией, число корней, особенности растения, метеорологические условия и др.
Подготовленные чистые пробирки с вложенными в них этикетками раскладывают по вариантам исследования около соответствующих растений или чашек Петри.
Непосредственно перед фиксацией готовят смесь Навашина. Для приготовления 1%-ного раствора хромовой кислоты берут 1 г хромового ангидрида и растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до 100 мл. 16%-й раствор формалина готовят так: берут 16 мл 40:%-го (неразведенного) формалина и доводят дистиллированной водой до 40 мл. Перед употреблением смешивают 10 ч. 1%-го раствора хромовой кислоты, 4 ч. 16%-го раствора формалина и 1 ч. ледяной уксусной кислоты. В пробирку наливают 7-10 мл готового фиксатора. Устанавливают ее вертикально без пробки в специальную подставку или небольшой стаканчик, на дно которого положена вата. Сверив этикетки, начинают фиксировать. Затем пробирки переносят в темное место, чтобы фиксатор не разлагался на свету.
6. Растения из вазонов, перевернув последние вверх дном, осторожно выбивают. При этом растение с комом земли держат в левой руке. Ножницами отрезают кончики молодых корней. Быстро помещают их в фиксатор и погружают в него стеклянной палочкой или встряхиванием пробирки. Зафиксировав достаточное число корней, сосуд с ними нужно поместить на 2-3 мин под колокол воздушного насоса, чтобы избавиться от пузырьков воздуха и облегчить проникновение фиксатора. Можно сделать и так: открытые пробирки с материалом, находящимся в фиксаторе Навашина, поместить в эксикатор, соединенный с водоструйным насосом. Это также ускоряет фиксацию.
Проросшие семена по одному вынимают пинцетом из бактериологических чашек, отрезают кончики корней и фиксируют.
Такая же последовательность работы соблюдается при фиксации эмбриологического материала. В этом случае при необходимости осуществляют кастрацию цветков и опыление.
Эмбриологический материал обычно фиксируют через определенные промежутки времени после нанесения пыльцы на рыльце (так называемая темпоральная фиксация). Для этого составляют график фиксаций в течение одних или нескольких суток, в зависимости от цели исследования. Чтобы ускорить проникновение фиксирующей смеси в крупные объекты, применяют метод вакуум-инфильтрации. Для этого собирают несложную установку, состоящую из эксикатора с краном, вакуумной резиновой трубки, тройника с краном и вакуумного насоса системы Комовского.
Продолжительность обработки зависит от состава фиксатора и объекта. Иногда возникает необходимость заменить фиксатор свежим. Например, фиксатор Навашина в летнее время быстро портится, что легко определить по внешнему виду жидкости. В этом случае корни или бутоны заливают свежей смесью. Хранить материал в фиксаторе можно лишь в отдельных случаях.
Промывание и обезвоживание
Промывание. При использовании наиболее распространенных фиксаторов (Кариуа, Навашина) материал через определенное время промывают, чтобы полностью удалить остатки фиксатора. После водных фиксаторов его промывают в проточной воде 1-3 ч, иногда дольше. Для этого объект вместе с этикеткой переносят из пробирок в марлевые мешочки, которые перевязывают суровыми нитками, и помещают в высокий стеклянный или фарфоровый стакан с воронкой, наполненный водой. Все это ставят под кран с проточной водой. Описанный способ промывки довольно прост и легко выполним, если в лаборатории нет специальных приборов. В летнее время материал промывают 1-2 ч, в зимнее – 2-3 ч. Более 3-4 ч промывать не рекомендуется, так как хромосомы после этого хуже окрашиваются, а края их оказываются как бы разъеденными.
Обезвоживание. Промыв материал в воде, его частично обезвоживают в этиловом спирте. Чтобы избежать сморщивания тканей, обезвоживание ведут постепенно, используя серии растворов спирта возрастающей концентрации. Марлевые мешочки вынимают по одному из стакана с водор и развязывают» Корни или бутоны вместе с этикеткой осторожно, но быстро, чтобы материал не подсох, переносят в пробирки с 20%-м раствором спирта, который затем заменяют 40, 60 и 80%-ми его растворами. В каждой из пробирок материал находится по 30 мин. В 80%-м растворе спирта его можно хранить длительное время. Для этого пробирки с корковыми пробками опускают концами в расплавленный парафин, чтобы спирт не улетучивался во время хранения.
После спиртовых фиксаторов, таких, как фиксатор Карнуа, материал промывают трижды по 1-2 ч в 80%-м растворе спирта, до полного исчезновения запаха уксусной кислоты. Для этого заранее готовят три склянки со спиртом одной концентрации и на них наклеивают этикетки: 80%-й спирт 1, 80%-й спирт 2 и 80%-й спирт 3. Из пробирок через марлю сливают фиксатор и тотчас же, не допуская подсыхания материала, наливают в них 80%-й раствор спирта 1, который через 1-2 ч заменяют раствором 2, а еще позднее - раствором 3. Промытый материал оставляют на хранение в 80%-м растворе спирта. Фиксированный материал можно хранить и в 70%-м растворе спирта.
Чтобы ускорить обезвоживание, можно промывать объект в 96%-м растворе спирта. Это делают после таких фиксаторов, как ледяная уксусная кислота, уксусный алкоголь.
Для окончательного удаления остатков воды из фиксированного материала, находящегося в 80%-м растворе спирта, его помещают еще в четыре его раствора: два из них имеют концентрацию 96% и два - по 100%. В каждом из них объект выдерживают около 1 ч. Более длительное пребывание фиксированного материала в 100%-м спирте придает ему хрупкость, что нежелательно.
Следует заметить, что спирт не только обезвоживает, но и несколько уплотняет ткани. И то, и другое необходимо для последующей заливки материала в парафин.
Пропитывание промежуточной жидкостью и парафином
Для получения тонких микротомных срезов толщиной в несколько микрометров материал необходимо залить в парафин, который представляет собой смесь углеводородов (реже используют целлоидин или желатин). Температура плавления его может быть различной. Для цитоэмбриологических исследований лучше брать парафин с температурой плавления 52-54 °С. Он не смешивается со спиртом и водой, но хорошо растворяется и хлороформе, ксилоле, бензоле, толуоле. Промышленность выпускает гомогенизированный парафин в виде полупрозрачных белых плиток без примесей и пузырьков воздуха. Имея набор парафинов с различной температурой плавления, можно составить из них нужное вещество.
Гомогенизированный парафин перед употреблением расплавляют и выдерживают в таком состоянии в термостате один или несколько дней для того, чтобы улетучились нежелательные примеси. К тугоплавкому парафину прибавляют 5% пчелиного воска. Для хрупких объектов к парафину с температурой плавления 54-60 °С, кроме воска, добавляют 5% стеарина. От механических примесей парафин освобождают фильтрованием в термостате на обычном фильтре. Так можно очищать все обрезки парафина, образовавшиеся во время работы.
Температуру плавления парафина легко определить следующим образом. Берут стеклянный капилляр, термометр и стакан с водой. Капилляр заполняют расплавленным парафином и после застывания парафина привязывают к термометру, помещают в стакан с водой, которую при этом медленно подогревают. Отмечают температуру в тот момент, когда парафин расплавится.
Успешно заключить объект в парафин удается только в том случае, если было проведено тщательное обезвоживание фиксированного материала в 96%-м растворе и 100%-м этиловом спирте. Однако и в этом случае его не сразу помещают в парафин, поскольку спирт с парафином не смешивается. Обычно после абсолютного спирта материал переносят в так называемую промежуточную жидкость - растворитель парафина, который позднее заменяют чистым парафином (табл. 1).
1. Растворители парафина и их основные свойства
Название растворителя
Растворение парафина при 50 °С, %
Температура кипения,
°С

Ксилол
20,8
140
Очень хорошая

Бензол
21,5
80
То же

Толуол
25,0
111
Растворяется с трудом

Хлороформ
25,0
61
Очень хорошая

Важнейшие требования к растворителю; он должен хорошо смешиваться со спиртом и растворять парафин при температуре его плавления, легко испаряться при той же температуре.
Хороший растворитель парафина для мелких объектов (корни и бутоны) - хлороформ, а для крупных - бензол и ксилол. Это обусловлено тем, что последние два растворителя не так быстро испаряются, как хлороформ, поэтому пропитывание материала парафином идет успешнее. Хлороформ, используемый как растворитель парафина, не должен содержать воды. Для этого его наливают в темную бутыль, на дно которой насыпают безводный хлорид кальция слоем 3-4 см и выдерживают некоторое время.
Обезвоженный в спирте материал пропитывают растворителем парафина не сразу, а постепенно. Обычно готовят три смеси хлороформа с абсолютным спиртом с постепенно возрастающей концентрацией хлороформа:
1 ч. хлороформа 4- 3 ч. абсолютного спирта;
1 ч. хлороформа 4- I ч. абсолютного спирта;
3 ч. хлороформа + 1 ч. абсолютного спирта.
В каждой из этих смесей материал выдерживают около часа. Для более крупных объектов время увеличивают. В дальнейшем материал переносят в первую, а затем во вторую склянку с чистым хлороформом, каждый раз оставляя в нем на час или более. После этого чистый хлороформ в объекте замещают на парафин следующим образом. Корни или бутоны вместе с этикеткой переносят в небольшие стеклянные стаканчики диаметром 2,5 см и высотой 3 см с хлороформом, уровень которого на 3-4 мм выше материала. В эти стаканчики наливают расплавленный парафин и ставят их в термостат с постоянной температурой 56-57 °С, т. е. на 2-3°С выше температуры плавления парафина. Здесь материал, выдерживают несколько суток. За это время хлороформ испаряется, а объект пропитывается парафином. Окончательное испарение хлороформа устанавливают по отсутствию запаха у парафина в стаканчиках (проверяют каждый стаканчик).
Термостат, в котором находится материал, должен иметь надежный терморегулятор, чтобы поддерживать постоянную температуру, не допуская больших скачков, отверстия для притока воздуха и оттока паров хлороформа и достаточно толстые стенки. Он не должен искрить. Промышленность выпускает для заливки парафина термостат ТВЗ-25. Электрические контакты терморегулятора не должны находиться на пути оттока паров бензола или ксилола, в противном случае возможем взрыв. Термостат необходимо поместить в вытяжной шкаф, так как пары хлороформа вредны для здоровья. При отсутствии вытяжного шкафа вентиляционное отверстие термостата соединяют с водоструйным насосом, выводной конец которого не должен выходить за пределы лаборатории.
Когда материал пропитается парафином, в стаканчики добавляют еще немного чистого расплавленного парафина и спустя некоторое время выливают содержимое в подготовленные бумажные коробочки (рис. 27), металлические или фарфоровые формочки, в которых парафин быстро застывает. При этом соблюдают такую последовательность работы.
Заранее готовят бумажные коробочки из пергамента или другой плотной бумаги.
Вынимают пинцетом этикетки из стаканчика, а содержимое выливают в коробочку.
Корни или бутоны быстро и равномерно раскладывают по дну коробочки нагретым пинцетом.
На поверхность слегка застывшего парафина осторожно кладут этикетку надписью вверх.
Коробочки помещают на поверхность холодной воды в широкую чашку. Охлаждение парафина необходимо для того, чтобы он меньше крошился во время резки на микротоме.




Рис. 27. Изготовление бумажных коробочек. Цифры указывают последовательность сгибания бумаги. По Д. Кисели.

Парафин вместе с объектами после охлаждения принимает форму коробочки, в которую его залили («парафиновый пряник»). Если сиять бумажную коробочку, то сквозь полупрозрачный парафин хорошо видны корни/или бутоны. В таком состоянии материал может долго храниться и легко выплавляется при изготовлении блоков.
Приготовление парафиновых блоков
Для работы на микротоме из «парафиновых пряников» готовят парафиновые блоки, которые укрепляют на деревянных держателях. Держатели устанавливают в объектодержателе микротома. Блок режут на определенную толщину.
В лабораторной практике деревянные держатели иначе называют кубиками. Их готовят из древесины дуба, бука, березы размером 1,5х2х2,5 см и перед употреблением пропитывают расплавленным парафином. На боковую сторону держателя приклеивают этикетку.
Готовят блоки двумя способами. В первом случае из «пряника» бритвой вырезают кусочки парафина с объектом и расплавленным парафином прикрепляют их к деревянному держателю. В таких блоках материал должен быть ориентирован определенным образом и окружен со всех сторон слоем парафина толщиной 1-2 мм. Обычно так готовят блоки, содержащие крупные эмбриологические объекты. Лезвием острой бритвы придают блоку форму параллелепипеда, грани которого параллельны граням держателя.
Во втором случае используют метод закапывания по С. Г. Навашину. Он более кропотлив, чем первый, но дает надежные результаты при заливке корней и мелких бутонов. Необходимо заранее приготовить для работы спиртовку, глазной зонд или серебряную проволочку, парафиновые палочки, этикетки, лезвие безопасной бритвы, скальпель, деревянные держатели и «парафиновый пряник» с материалом.
Парафиновые палочки делают из парафина с такой же температурой плавления, какую имел парафин, использованный для пропитывания материала в термостате. В парафин добавляют 5% воска. Расплавленный и отфильтрованный парафин заливают в коробочки из пергамента длиной 15 см, шириной 30 мм и толщиной 5-8 мм. Коробочки быстро охлаждают в воде, снимают бумагу, а палочки хранят в пустых эксикаторах или картонных коробках.
Правильно залитый блок должен быть однородным. Это удается, когда новые капли парафина наносят на иезастывшую поверхность блока. Закапывание продолжают до тех пор, пока объекты не окажутся внутри прозрачной капли, из которой при остывании не должны выступать кончики корней.
Блок вместе с держателем опускают в холодную воду. После остывания лезвием безопасной бритвы ему придают форму правильного параллелепипеда или усеченной пирамиды. Обрезку парафинового блока начинают с верхней поверхности. Осторожно снимают лишний парафин, оставляя над объектом слой 2 мм. Затем обрезают блок с боковых сторон, добиваясь, чтобы грани его были параллельны граням деревянного держателя.
Таким образом, объекты заключены в парафиновый блок определенной формы, который можно резать на микротоме.
Получение микротомных срезов
Лабораторный прибор, предназначенный для получения тонких срезов у различных объектов, называют, микротомом. Тонкие срезы с объектов, залитых в парафиновые блоки, готовят на микротомах двух типов: салазочном, или санном, и ротационном (рис. 30, А, Б).
Наиболее распространен салазочный микротом, у которого нож свободно перемещается на салазках, а деревянный держатель с парафиновым блоком прочно укреплен в объектодержателе, который может подниматься на определенную высоту при помощи микрометрического винта или перемещаться но наклонной плоскости вверх.



Рис. 30. Микротомы: А - ротационный; Б - салазочный (А, В - по Прозиной, 1960); В - замораживающий; 1 - станина; 2 - ножедержатель; 3 - нож; 4 - замораживающий столик; 5 - игольчатый клапан; 6 - микрометрический винт.

В ротационном микротоме нож укреплен неподвижно острием вверх, а объект движется по вертикали при помощи специального подающего механизма, снабженного колесом или рукояткой. Кроме рассмотренных двух, существует еще микротом замораживающего типа (рис. 30, В), на котором режут объекты в замороженном состоянии. На столик такого микротома в каплю воды помещают объект и подают к нему угольную кислоту под давлением. Столик охлаждается, объект становится неподвижным в капле, после чего его можно резать. В некоторых случаях охлаждают .не только столик, но и нож. Метод замораживания применяют при диагностических, гистохимических, анатомических и других исследованиях. Здесь трудно получить тонкие срезы, а также непрерывную серию срезов, но зато он прост и требует немного времени.



Рис. 31. Схематическое изображение правильного (А) и неправильного (Б, В) наклонов ножа. По Ромейсу.

Важнейшая составная часть микротомов - ножи (бритвы). Микротомные ножи делят на две группы: с плосковогнутой и плоской с двух сторон формой. Первые используют для резки объектов, залитых в парафин, а вторые - для резки замороженных и труднорежущихся объектов. Микротомный нож требует тщательного ухода и бережного отношения. Небольшой удар или прикосновение лезвием к плотному предмету портит его. После работы нож вытирают насухо и хранят в футляре. Его необходимо своевременно точить и править. От этих операций зависит качество срезов. При точке влажный нож ведут по камню (из песчаника или карборунда) против лезвия в том и другом направлениях, оборачивая его вокруг обушка на конечных пунктах движения. Перед резкой на микротоме нож правят на ремне для шлифовки фасеток и придания грани большей работоспособности. Нож ведут обушком вперед поперек ремня по всей его длине, используя в работе нижнюю сторону ремня. При правке нож смачивают водой.
Качество срезов на салазочном микротоме зависит от установки наклона ножа, определяемого углом, который образует нижняя поверхность ножа с плоскостью среза объекта. Этот угол должен составлять 2-5°. Допустимо положение, при котором сетка параллельна плоскости резания (рис.31).
Последовательность работы на санном микротоме.
Микротом очищают от пыли и парафиновых стружек, а движущиеся части смазывают вазелиновым маслом. В камеру с микротомом, изготовленную из фанеры или плексигласа (размеры ее зависят от размеров микротома), ставят лампу для подогревания ножа и блока в холодное время.
Подготовленный острый нож плосковогнутого типа устанавливают под определенным углом так, чтобы фасетка лезвия была параллельна граням парафинового блока и перпендикулярна направлению движения. Во время работы нож вытирают тряпочкой, смоченной в ксилоле.
Закрепляют деревянный держатель с парафиновым блоком в объектодержателе так, чтобы получить поперечные или продольные срезы. Нож и верхнюю поверхность парафинового блока осторожно сближают.
Устанавливают микрометрическим винтом необходимую толщину срезов в микрометрах. Она зависит от объекта и цели исследования. Так, для наблюдения митохондрий толщина срезов - до 5 мкм, для подсчета числа хромосом в корнях – 10-15, а при эмбриологических исследованиях – 15-25 мкм.
Приступают к резке парафинового блока. Для этого при заднем положении ножа подают объектодержатель на толщину среза, например на 12 мкм. В результате парафиновый блок поднимается вверх к фасетке ножа на это же расстояние. Затем перемещают салазки с ножом к себе и срезают слой парафинового блока толщиной 12 мкм. Отодвинув назад салазки с ножом, снова подают объект при помощи микрометрического винта и передвигают салазки с ножом к себе. Так делают второй срез и т. д. В результате получается непрерывная лента срезов. Если нож во время работы стучит, следовательно, его наклон недостаточен.
Срезы в виде ленты снимают с ножа мягкой кисточкой и укладывают в определенной последовательности на черную поверхность дна длинной, но неглубокой коробки, в которую помещают этикетку. Верхняя и нижняя поверхности ленты неодинаковы по внешнему виду: первая матовая, вторая блестящая. Ленту укладывают в коробку, не переворачивая ее, т. е. блестящей стороной вниз. После этого приступают к наклеиванию срезов па предметные стекла. Микротом после работы необходимо очистить от стружек и поместить в футляр.
Неудачи при изготовлении срезов.
Срезы мнутся и прилипают к ножу. Это может быть вызвано высокой температурой в камере с микротомом или тем, что взятый для заливки парафин оказался слишком мягким. Указанные причины можно устранить изменением температуры в камере и перезаливкой материала в более твердый парафин.
Срезы крошатся. Это происходит из-за низкой температуры в камере или оттого, что парафин слишком твердый и медленно охлаждается во время заливки блока. Обе причины также устранимы.
Срезы полосатые, раскалываются вдоль. Объясняются подобные дефекты тем, что нож имеет зазубрины. В таком случае его передвигают.
Срезы сдергиваются с ножа при его обратном ходе. Это значит, что нож грязный с нижней стороны и его необходимо вычистить.
Лента искривляется. Часто такое явление наблюдается потому, что передний и задний края блока не параллельны лезвию ножа. Для его устранения осторожно обрезают парафиновый блок, придав ему правильную форму. Микротом делает «пропуски» или срезы получаются неодинаковой толщины. Следовательно, нож стоит слишком полого и необходимо изменить его наклон.
Срезы получаются волнистые (гофрированные). Чаще всего это объясняется плохой заливкой блока, и необходимо залить блок снова.
Объект выпадает из блока во время резки на микротоме. Это явление может быть вызвано плохим пропитыванием материала, что не всегда удается устранить. Другая причина его может заключаться в том, что материал пропитывался в термостате более мягким парафином, чем тот, которым закапывался блок. Необходимо также проверить, не затупился ли нож.
Наклейка парафиновых срезов на предметные стекла
Подготовка предметных и покровных стекол, Очень важный момент в работе - подбор предметных и покровных стекол для препаратов. От толщины стекол зависит правильная фокусировка препаратов. Световой микроскоп имеет объективы с определенным рабочим расстоянием (у иммерсионных объективов оно равно 0,1-0,12 мм). Ясно, что этими объективами можно воспользоваться в том случае, если толщина предметного и покровного стекол не выходит за допустимые величины, а именно 1-1,2 мм для предметных и 0,17 мм для покровных стекол. Кроме того, стекла должны иметь ровную поверхность, без мутных пятен и царапин. Поэтому предварительно следует отбраковать стекла.
Следующий момент, на который необходимо заранее обратить внимание, - чистота стекол. Наклеенные срезы хорошо держатся только на абсолютно чистой поверхности.
Обычно предметные стекла очищают так: кипятят в мыльной воде, промывают в водопроводной и при необходимости опускают в хромовую смесь, состоящую из трех частей насыщенного водного раствора бихромата калия и одной части концентрированной серной кислоты. При этом нужно помнить, что кислоту вливают в дихромат калия, а не наоборот.
Из хромовой смеси стекла вынимают пинцетом и промывают проточной и дистиллированной водой. У чистых стекол поверхность полностью смачивается водой. Отобранные стекла помещают в стакан с дистиллированной водой, где они хранятся до употребления. Очень удобны в работе предметные стекла с матированными концами, на которых можно делать надписи обычным карандашом.
Покровные стекла отбирают размером 20х20 или 24х24 мм, более крупные применяют только для эмбриологических исследований. Очищают стекла в смеси спирта и эфира, вытирают мягкой тряпочкой и хранят в сухом виде до использования.
Наклейка парафиновых срезов. Подготовив предметные стекла, можно приступить к наклеиванию парафиновых срезов. Для этого вынимают пинцетом одно стекло из сосуда с дистиллированной водой и, держа его пальцами за края, вытирают чистой тряпочкой нижнюю поверхность. Затем кладут стекло на ровную поверхность стола.
Наклеивать срезы можно разными способами. Наиболее распространенный способ с использованием обычной дистиллированной воды. Однако он дает хорошие результаты, только если предметные стекла будут абсолютно чистыми.

Рис. 32. Нагревательный столик для расправления микротомных срезов:
1 - предметное стекло с препаратом. По М. Н. Прозиной.

Порядок работы следующий. На поверхность предметного стекла из капельницы наносят несколько капель дистиллированной воды. Скальпелем разрезают парафиновую ленту на отрезки с равным количеством срезов. Каждый отрезок переносят скальпелем на поверхность воды, соблюдая последовательность расположения срезов. Необходимо также следить, чтобы нижняя (блестящая) сторона их непосредственно касалась воды. Общее число срезов, которые можно уложить на одно предметное стекло, рассчитывают, принимая во внимание величину покровного стекла. Отрезки парафиновой ленты лучше укладывать перпендикулярно длинной стороне предметного стекла.
Сморщенные парафиновые срезы надо расправить. Для этого предметные стекла со срезами, плавающими в воде, переносят на ровную поверхность нагревательного столика (приспособление для сушки и расправления парафиновых срезов на предметных стеклах, рис. 32), имеющего латунную пластинку с подогревом от электротока. Во время расправления срезов следят, чтобы со стекол не испарилась вода. Срезы можно расправить и под лампой, а также на подогретых асбоцементных пластинках. Теплые предметные стекла с расправленными срезами переносят на черную поверхность стеклянной пластинки (можно использовать фотопластинки).
Теперь очень важно расправленные срезы правильно и вплотную уложить так, чтобы они были друг против друга в вертикальном и горизонтальном положениях. Вместе с тем срезы должны находиться в центре предметного стекла и не выходить за контуры покровного. Чтобы аккуратно уложить срезы, сна чала удаляют избыток дистиллированной воды фильтровальной бумагой и скальпелем поправляют их. Окончательно удаляют воду уже после того, как срезы уложены. Для этого на них сверху помещают полоску фильтровальной бумаги и осторожно проводят по ней пальцем. Последнее можно делать только тогда, когда срезы остыли, иначе они приклеятся к бумаге.
Предметное стекло со срезами подписывают обычным графитовым карандашом, если оно матировано, или тушью с белком, для чего жидкую черную тушь смешивают с равным объемом смеси куриного белка с глицерином. Используют также алмазный карандаш. Затем предметное стекло немедленно ставят сушить в термостат при температуре 40°С. Следует помнить, что если срезы высохнут при комнатной температуре, они потом отстанут от стекла. Сушку в термостате ведут двое-трое суток.
Срезы пристают к стеклу вследствие капиллярного притяжения. Если они приклеены хорошо, при просматривании их с нижней стороны предметного стекла не должно быть отсвечивающих мест. Последнее указывает на то, что между стеклом и срезами остался воздух. Такие срезы легко отклеятся, как. только окажутся в жидкости.
Существуют и другие способы наклеивания срезов на предметные стекла, например с использованием белка с глицерином. Для этого к свежему куриному белку добавляют равный объем глицерина. После взбалтывания смесь фильтруют. Фильтрация протекает медленно. В фильтрат добавляют кристаллик антисептика (тимола, фенола).
Есть два варианта наклеивания срезов белком: сухой и водный. В первом случае на предметное стекло наносят каплю белка с глицерином и кончиком пальца или льняной тряпочкой растирают его тонким слоем. Переносят срезы на стекло кисточкой. Сначала к стеклу прижимают один угол среза, а потом и весь срез. Предметные стекла со срезами подогревают, после чего их можно сразу подвергнуть дальнейшей обработке.
Белково-глицериновую смесь можно разводить водой: 1 каплю смеси взбалтывают с 4 мл дистиллированной воды. Воду с белком и глицерином наносят пипеткой на предметное стекло, в нее помещают срезы. Срезы расправляют на нагревательном столике, удаляют избыток жидкости и сушат.
Удаление парафина и окрашивание срезов
Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стекла, непосредственно изучать под микроскопом трудно. Для выявления отдельных компонентов клетки необходимо освободить их от парафина, а затем окрасить. Последовательность работы следующая.
Освобождение срезов от парафина ксилолом.
Удаление ксилола путем замещения его на 96%-й раствор спирта.
Удаление спирта промывкой срезов в воде.
Протравливание с последующей промывкой (применяется не всегда).
Окрашивание и промывание.
Дифференцирование и промывание (применяется не всегда).
Обезвоживание срезов в 96%-м растворе и 100%-м спирте.
Замещение спирта на ксилол.
Заключение в канадский бальзам.
Приведенная схема берется за основу при различных методах окрашивания постоянных препаратов, отличающихся в деталях в зависимости от того, применяют один или несколько красителей, какой используют способ окрашивания, как проводят обезвоживание и т. д.
Перед началом работы выбирают метод окрашивания, составляют схему работы, подбирают посуду и готовят растворы. Очень удобны цилиндрические сосуды высотой 11-12 см и диаметром 5 см с притертыми крышками. Эти сосуды с наклеенными этикетками в определенной последовательности помещают в деревянные бруски с гнездами. Одновременно готовят стаканы для промывания препаратов в воде, капельницы с ксилолом, абсолютным этиловым спиртом и 96%-м его раствором, чистые покровные стекла, пинцеты, канадский бальзам, марлю и фильтровальную бумагу. Для дифференцировки необходимы набор кювет с растворителем и микроскоп. Канадский бальзам готовят, растворяя кристаллы бальзама в ксилоле до консистенции, напоминающей жидкий пчелиный мед.
Переносят препараты из одного сосуда в другой пинцетом, избегая загрязнения реактивов, что может отразиться на качестве препаратов. Например, ксилол можно занести в спирт, и тогда при последующем переносе препаратов в воду они станут мутными. При переносе препаратов из одной жидкости в другую принято обмывать их из капельницы с обеих сторон. Например, после ксилола препарат обмывают 96%-м раствором спирта, а затем переносят в сосуд с таким же раствором. Обмывают препарат и перед переносом его в абсолютный спирт, чтобы не занести в него воду. Ни в коем случае нельзя допускать подсыхания срезов во время переноса препаратов из одной жидкости в другую.
Для каждого объекта выбирают свой метод окрашивания в зависимости от цели исследования и фиксатора. Различные структуры в клетке неодинаково воспринимают и удерживают красители. Все известные красители по своему происхождению делят на три группы: растительного происхождения, животного и синтетические. Последние, в свою очередь, делят на основные, кислые и нейтральные. Для окраски ядер используют основные синтетические красители (генциановый фиолетовый), а также растительного (гематоксилин) и животного (кармин) происхождения. Растворы красителей могут быть спиртовыми и водными. В последние добавляют кристаллик антисептика - тимола.
Существующие методы окрашивания можно разделить на две группы. При первой - с прогрессивным окрашиванием - срезы помещают в слабый раствор красителя. Окрашивание длится несколько минут, пока необходимые структуры в клетке не будут четко видны на препарате. При второй - с регрессивным окрашиванием - срезы заведомо перекрашивают концентрированным раствором красителя. Избыток краски удаляют со срезов в специально подобранных растворах. Этот прием называют дифференцированием препаратов, в ходе которого краску следует оставить только на определенных структурах клетки. Контроль за дифференцированием ведут под микроскопом, используя объективы с небольшим увеличением.
Окрашивание срезов гематоксилином по Гейденгайну. Гематоксилин готовят из экстракта кампешевого дерева. Для окрашивания срезов используется продукт окисления гематоксилина - гематеин (C16H12O6). Существует два способа приготовления красителя.
Первый способ (ускоренный, часто используется в лабораториях), 1 г гематоксилина растворяют в 100 мл дистиллированной воды в колбе при кипячении на водяной бане в течение 30-60 мин. После, остывания раствор фильтруют четыре раза для окисления гематоксилина и добавляют кристаллик тимола. Необходимо сразу обратить внимание на цвет готового красителя. Он должен быть ярко-красным или красно-бурым. Желтоватый оттенок указывает на его невысокое качество, в результате чего трудно получить хорошую окраску срезов.
Приготовленный краситель разводят перед употреблением равным объемом дистиллированной воды.
Второй способ. 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96%-го раствора этилового спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды, выдерживают на свету 3-4 недели, затем фильтруют и разводят перед употреблением.
Гематоксилин по Гейденгайну применяют для окрашивания цитологических и эмбриологических препаратов. При окраске хромосом хорошие результаты получают при использовании фиксатора Навашина. Этот же краситель применяют для окраски митохондрий.
Во время окрашивания срезов надо стремиться не загрязнить краситель. Окрасив небольшую партию препаратов, его нужно отфильтровать и вновь использовать. Перед употреблением хранившегося красителя сначала определяют его пригодность для работы. Для этого в стакан с водопроводной водой вливают несколько капель гематоксилина. Испорченный краситель дает желтую или грязно-лиловую окраску, нормальный – аметисто-лиловую.
Необходимо заранее приготовить деревянные бруски с гнездами и цилиндрические сосуды с притертыми крышками. На сосуды наклеивают этикетки с указанием реактивов. Кроме того, готовят стаканы для воды, капельницы с абсолютным спиртом и 96%-м его раствором и ксилолом, чистые покровные стекла, пинцеты с широкими концами, нарезанную фильтровальную бумагу и марлевые салфетки, кюветы для дифференцирования, микроскоп, реактивы: метаксилол, абсолютный этиловый спирт и 96%-й его раствор, 0,5-1%-й раствор гематоксилина, 2%-й и 4%-й растворы железоаммонийных квасцов, канадский бальзам.
Во время работы следует соблюдать такую последовательность.
Помещают предметные стекла с наклеенными срезами в первый сосуд с ксилолом для удаления парафина. Длительность пребывания срезов в нем 10-30 мин, однако, можно задержать препараты здесь и на более длительное время. Стекла ставят в сосуд с ксилолом парами, срезами наружу. Каждую пару стекол перекладывают фильтровальной бумагой или спичками.
Переносят стекла со срезами во второй сосуд со свежим ксилолом на 5 мин.
Обмывают каждое стекло 96% -м раствором спирта из капельницы и помещают в сосуд с этим же раствором. Длительность пребывания срезов в спирте 5 мин, иногда это время следует увеличить до 15-30 мин.
Промывают стекла со срезами в трех сменах дистиллированной воды по 5-10 мин. Стекла не должны иметь жирных следов и быть мутными.
Помещают стекла со срезами в 4%-й раствор железоаммонийных квасцов для протравливания на 4-6 ч.
Тщательно промывают стекла в дистиллированной воде в течение 5-10 мин.
Помещают стекла со срезами в 0,1-1%-й раствор гематоксилина на 10-12 ч.
Промывают стекла со срезами сначала в водопроводной, а потом в дистиллированной воде по 10-15 мин.
Дифференцируют срезы в 2%-м растворе железоаммонийных квасцов, в котором они быстро теряют краситель и из черных становятся синими. Окончательную дифференцировку ведут под микроскопом после промывки в дистиллированной воде, чтобы установить момент почти полной потери красителя цитоплазмой. Ядра должны оставаться интенсивно окрашенными.
Промывают отдифференцированные срезы в проточной воде в течение 15 мин.
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта из капельницы и помещают в сосуд с этим же раствором на 5-15 мин.
Обмывают стекла со срезами абсолютным спиртом из капельницы и помещают в сосуд с этим же спиртом на 10-15 мин.
Помещают стекла со срезами в смесь 100%-го спирта и ксилола на 3-5 мин.
Обмывают стекла со срезами ксилолом из капельницы и помещают в третий сосуд с ксилолом на 15 мин, затем в четвертый - на, 5 мин.
Заключают срезы в канадский бальзам.
Для рассматриваемого способа окрашивания характерно протравливание срезов железоаммонийными квасцами. При последующем действии красителя образуется черный железогематеиновый лак, который неодинаково удерживается различными структурами клетки. Окраска сохраняется многие годы. Цитоплазму, ядрышки и оболочку можно подкрашивать сразу после дифференцировки 1%-м раствором эозина.
Срезы, заключенные в бальзам, во время просмотра их под микроскопом выглядят иначе, чем в воде. Хромосомы имеют темно-синий цвет, цитоплазма и оболочки - бесцветные, если не было подкраски.
Существует ускоренный способ окрашивания срезов железным гематоксилином. В этом случае протравливание в квасцах и окрашивание в гематоксилине ведут в течение 30-40 мин в термостате при температуре 45-56°С.
Окрашивание срезов гематоксилином по Делафильду. Этот способ чаще используют в работе с эмбриологическими препаратами. Хорошие результаты получаются только при правильном приготовлении красителя. К 100 мл насыщенного водного раствора алюмоаммонийных квасцов прибавляют по каплям раствор, состоящий из 1 г гематоксилина, растворенного в 6 мл абсолютного спирта. Полученный раствор ставят на неделю на свет в колбе с неплотной пробкой для доступа воздуха. Затем в колбу добавляют по 25 мл глицерина и метилового спирта и не ранее чем через 4 ч раствор фильтруют.
Краситель готов к употреблению спустя 1-2 мес. Его можно долго хранить в темном месте. Перед употреблением краситель разводят в 3-4 раза дистиллированной водой.
Последовательность работы следующая.
Помещают предметные стекла со срезами в первый сосуд с ксилолом на 10-30 мин, а затем во второй - на 5 мин.
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта из капельницы и помещают в сосуд с таким же спиртом на 5-30 мин.
Промывают стекла со срезами в двух сменах дистиллированной воды в течение 3-5 мин.
Помещают стекла со срезами в гематоксилин Делафильда на 5-10 мин.
Промывают стекла со срезами в водопроводной, а потом в дистиллированной воде 5 мин. Если срезы перекрашены, их можно дифференцировать в спирте, подкисленном соляной кислотой.
Переносят стекла со срезами в 1%-й раствор эозина на 1-2 мин (1 г эозина растворяют в 100 мл 70%-го раствора спирта или в дистиллированной воде). Дифференцировку срезов проводят в 96%-м растворе спирта.
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и переносят в сосуд с таким же раствором. Продолжительность пребывания в спирте контролируют при помощи микроскопа, так как в спирте идет дифференцировка срезов. Эозин должен подкрасить цитоплазму и ядрышки.
Обмывают 100%-м спиртом стекла со срезами и переносят сосуд с таким же спиртом на 1-3 мин.
Переносят стекла со срезами в смесь 100%-го спирта и ксилола на 1-3 мин.
Обмывают стекла со срезами ксилолом и переносят в третий сосуд с ксилолом на 5-10 мин, а затем в четвертый - на 5 мин.
Заключают срезы в канадский бальзам.
Срезы, окрашенные по Делафильду, имеют ядра и хромосомы синего цвета. Эозин подкрашивает цитоплазму и ядрышки в малиновый цвет. Окраска сохраняется многие годы, \ Окрашивание срезов генциановым фиолетовым по Ньютону. Метод применяют для окрашивания цитологических и эмбриологических препаратов. Он занимает мало времени. Хромосомы окрашиваются в фиолетовый цвет, оставаясь полупрозрачными, что облегчает подсчет длинных, налегающих друг на друга хромосом. Окраска менее долговечна, чем при использовании предыдущих красителей.
Генциановый фиолетовый состоит из кристаллического фиолетового и примесей. Желательно брать чистый краситель, так как примеси окрашивают цитоплазму, что отрицательно сказывается на контрастности структур клетки. Для приготовления красителя растворяют 1 г генцианового фиолетового в 100 мл дистиллированной воды.
Последовательность работы следующая.
Помещают стекла со срезами в первый сосуд с ксилолом на 10-30 мин, затем во второй - на 5 мин.
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта из капельницы и переносят их в сосуд с таким же раствором на 10-15 мин.
Промывают стекла со срезами в дистиллированной воде 3-5 мин.
Помещают стекла со срезами в 1%-й раствор генцианового фиолетового на 5 мин или дольше в зависимости от объекта.
Промывают стекла со срезами в дистиллированной воде в течение нескольких секунд.
Помещают стекла со срезами на 30 с в раствор: 1 г йода + 1 г йодида калия в 100 мл 80%-го раствора спирта (вместо спирта можно брать воду).
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и помещают в сосуд с таким же раствором на 2-3 с.
Обмывают стекла со срезами 100%-м спиртом и помещают в сосуд с ним на несколько секунд, но можно задержать дольше, чтобы улучшить обезвоживание.
Дифференцировку проводят в гвоздичном масле, а при его отсутствии - в карбол-ксилоле. Для приготовления последнего 70-80 мл ксилола смешивают с 20-25 мл расплавленного фенола. Колбу с фенолом подогревают на водяной бане. Можно дифференцировать в смеси гвоздичного масла и ксилола (1: 1).
Помещают стекла со срезами в третий сосуд с ксилолом , на несколько секунд, а эатем в четвертый на несколько минут.
Заключают срезы в канадский бальзам.
Окрашивание срезов ацетокармином по Фаворскому. В цитологической практике ацетокармин обычно применяют для окрашивания временных препаратов. Однако его можно использовать и для приготовления постоянных препаратов. Н. В. Фаворский предложил два способа окрашивания.
Первый способ. На предметные стекла со срезами, освобожденными от парафина в ксилоле и доведенными до дистиллированной воды, накапывают ацетокармин (приготовление ацето-кармина, см. с. 98). Срезы окрашивают несколько минут или стекла с ними подогревают на спиртовке до появления паров. Избыток ацетокармина сливают, стекла со срезами ополаски вают водой и дифференцируют в 0,5%-м растворе аммиака под микроскопом (выпускаемый промышленностью аммиак принимают за 100%-й). Затем их промывают в воде в течение 5 мин, обезвоживают в 96%-м растворе и 100%-м спирте, замещают спирт на ксилол и заключают срезы в канадский бальзам. Такие препараты по цвету сходны с препаратами, окрашенными по Фёльгеиу.
Второй способ. Срезы окрашивают в ацетокармине в течение 5 минут, промывают в воде, а затем переносят в 3-5%-й раствор железоаммонийных квасцов и нагревают до появления паров. Стекла со срезами хорошо промывают в воде, обезвоживают в спиртах, переносят в ксилол, а затем заключают срезы в канадский бальзам. Хромосомы приобретают черный цвет.
Окрашивание срезов по Модилевскому. Эмбриологические препараты можно хорошо окрасить, применяя следующую схему работы.
Депарафинированиые, т. е. освобожденные от парафина в ксилоле и промытые в спирте, срезы доводят до воды (см. с. 86).
Окрашивают срезы 0,25%-м водным раствором фуксина основного в течение 3 мин. Иногда время окрашивания может длиться несколько часов.
Промытые в воде срезы дифференцируют в 96%-м растворе спирта, пока не станут резко видны включения в цитоплазме, хроматиновые элементы и ядрышки в ядре.
Обезвоживают срезы в абсолютном спирте.
На предметное стекло со срезами наносят анилин с растворенным в нем красителем, например лихтгрюном, метиленовой синей, азуром 1 или азуром 2. Анилин (C6H5NH2) представляет собой бесцветную жидкость, малорастворимую в воде. Вместо него можно взять гвоздичное масло. Продолжительность окрашивания от 2 до 10 мин.
Дифференцируют срезы в смеси толуола или ксилола со спиртом (4:1).
Срезы помещают в толуол или ксилол, а затем заключают в бальзам.
Методика окрашивания хромосом у отдаленных гибридов по Элленгорну. Я. Е. Элленгорн (1947) изучал на микротомных препаратах мейоз у ржано-пырейного гибрида первого поколения Secale cereateXAgropyron glaucum. Оказалось, что при определенных условиях окрашивания препаратов можно наблюдать различие в окраске хромосом родительских пар. Колосья А.Я. Элленгорн фиксировал по Карнуа. Депарафинированные препараты протравливал железоаммонийными квасцами и окрашивал гематоксилином Гейденгайна, смешанным с равным объемом буферного раствора с рН 5. После дифференцировки препаратов хромосомы ржи (Secale се reale), которые вели себя как униваленты, оказались окрашенными в черный цвет, а хромосомы пырея сизого {Agropyron glaucum) - в серый.
Окрашивание срезов для выявления нуклеиновых кислот, белков и углеводов. Для выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты в ядрах клеток применяют реакцию Фёльгена, Известно, что в состав ДНК входят остатки фосфорной кислоты, сахар (а-дезоксирибоза) и азотистые основания. Дезоксирибоза в ходе гидролиза с соляной кислотой превращается в альдегид, который при взаимодействии с фуксино-сернистой кислотой (реактив Шиффа) окрашивается в красновато-фиолетовый цвет. Таким образом, реакция Фёльгена состоит из двух этапов: гидролиза и окрашивания. В качестве контроля используются препараты, не подвергавшиеся гидролизу. Их помещают в фуксииосернистую кислоту на 10-15 мин. Окрашивания не должно быть.
Для успешного проведения этой работы необходимо приготовить следующие растворы:
фуксиносернистая кислота (реактив Шиффа). Растворяют 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты (обратить внимание на сложное название фуксина!) в 200 мл кипящей воды, остужают до 50°С и прибавляют 20 мл 1 н. соляной кислоты; остужают до 25 °С и прибавляют 1 г сухого метадисульфита натрия (Na2S2О5). Раствор помещают в цилиндрический сосуд, оклеенный снаружи черной бумагой (кроме дна). Через сутки жидкость обесцвечивается. Чтобы определить это, сосуд ставят на белую бумагу, открывают крышку и смотрят внутрь. Иногда жидкость имеет слабо-желтый цвет;
сернистая вода. К 200 мл проточной воды прибавляют 10 мл 10%-го раствора метадисульфита натрия и 10 мл 1 н. соляной кислоты. Используют в работе только свежий раствор;
соляная кислота, 1 н. раствор. Берут одну ампулу ОД н. фиксанала соляной кислоты и доводят ее содержимое дистиллированной водой до 100 мл. Получается 100 мл 1 н. соляной кислоты. Можно приготовить 1 н. раствор соляной кислоты и так: 82,5 мл НС1 (плотность 1,19) доводят до 1 л водой.
Наклеивать срезы на предметные стекла при этом методе иногда приходится белком. Последовательность работы следующая.
Помещают предметные стекла со срезами в первый сосуд с ксилолом на 10-30 мин для удаления парафина и затем во второй - на несколько минут.
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и помещают в сосуд с таким же раствором на 10-15 мин.
Промывают стекла со срезами в дистиллированной воде в течение 3-5 мин.
Ополаскивают стекла со срезами 1 и. НС1 и помещают в сосуд с 1 н. НС1 с температурой 60°С для гидролиза. Сосуд должен находиться на водяной бане при постоянном контроле за температурой соляной кислоты. Время гидролиза при использовании фиксатора Карнуа или 10%-го раствора формалина 8 мин. Однако обычно его устанавливают в ходе работы по максимальной интенсивности цветной реакции.
Предметные стекла со срезами быстро остужают в холодной 1 н НС1.
Помещают стекла со срезами в реактив Шиффа на 1-2 ч.
Переносят стекла со срезами последовательно в три сосуда с растворами сернистой воды (1, 2, 3) и держат в каждом из них по 2-5 мин.
Промывают стекла со срезами в проточной воде 15 мин, а затем в дистиллированной воде.
Подкрашивают срезы 12%-м водным или спиртовым раствором лихтгрюна.
Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и помещают в такой же раствор на 1-2 мин.
П. Обмывают стекла со срезами 100%-м спиртом и помещают в сосуд с ним на несколько минут.
Помещают стекла со срезами в третий сосуд с ксилолом на 5-10 мин, а затем в четвертый - на несколько минут.
Заключают срезы в канадский бальзам.
На интенсивность реакции Фёльгена влияют продолжительность гидролиза и присутствие в клетке ряда веществ. Эта реакция идет медленнее при наличии солей железа, дубильных веществ и некоторых белков. Ее можно использовать для цитофотометрии ДНК в ядре клетки.
Содержание и локализацию' нуклеиновых кислот в клетке можно определить, используя основные красители в сочетании с обработкой срезов ферментами-нуклеазами, способными разрывать связи между нуклеотидами ДНК или РНК.
Хорошими красителями для нуклеиновых кислот являются галлоцианин (или оксазин) и толуидшовый синий. Галлоцианин с хромовыми квасцами дает соединение краплак-катион, которое с фосфатными группами нуклеиновых кислот образует соли темно-синего цвета. Чтобы исключить влияние белков, окрашивание нуклеиновых кислот нужно вести при рН 1,51,6.
Для приготовления красителя берут 5 г хромовых квасцов, растворяют их в 100 мл воды и добавляют 0,15 г галлоцианииа. Смесь встряхивают, а затем нагревают до кипения. Длительность кипения 5 мин. После этого раствор охлаждают, фильтруют и доводят водой через фильтр до 100 мл. Краситель имеет рН 1,64. Последовательность работы следующая.
Депарафинированные срезы доводят до воды (см. с. 86).
Окрашивают срезы раствором красителя в течение двух суток при комнатной температуре.
Промывают срезы в воде и обезвоживают.
Просветляют срезы в ксилоле и заключают в бальзам. Чтобы выявить содержание и локализацию одной из двух кислот (ДНК или РНК), препараты перед окрашиванием обрабатывают нуклеазами. Если после обработки рибонуклеазой окраска препарата ослабляется, то это происходит вследствие удаления РНК.
ДНК и РНК можно выявить красителями метиловым зеленым и пиронином с использованием рибонуклеазы по Браше.
Для этого готовят два раствора.
Раствор 1 состоит из 17,5 мл 5%-го водного раствора пиронина, 10 мл 2%-го метилового зеленого и 250 мл воды. Раствор хранят в холодильнике.
Чтобы очистить метиловый зеленый от примеси метилового фиолетового, к раствору красителя добавляют равный объем хлороформа, встряхивают смесь и оставляют на 1-2 дня для отстоя. Делительной воронкой отделяют верхний слой с метиловым зеленым от нижнего слоя. Эту процедуру повторяют несколько раз.
Раствор 2 представляет собой ацетатный буфер с рН 4,8. Для приготовления буфера в мерную колбу наливают 1,2 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем до 100 мл. Затем отдельно растворяют в 100 мл воды 2,72 г ацетата натрия. Смешивают 74 мл раствора уксусной кислоты со 100 мл раствора ацетата натрия. Получается буфер с рН 4,8.
Перед употреблением растворы 1 и 2 смешивают в равных объемах. Последовательность работы следующая.
Депарафинированные срезы доводят до воды.
Помещают срезы в буферный раствор красителей на 20 мин, а затем омывают водой.
Обезвоживают срезы в ацетоне и последовательно переносят их в две смеси ацетона с ксилолом (10% ацетона и 90% ксилола, 50% ацетона и 50% ксилола).
Помещают срезы в ксилол, затем заключают в бальзам.
На препаратах метиловый зеленый окрашивает ДНК в зеленый цвет, а пиронин окрашивает РНК в красный. При этом параллельные препараты перед окрашиванием обрабатывают нуклеазами, например 0,1%-м водным раствором рибонуклеазы в течение 2-3 ч при температуре 37°С. Вместо рибонуклеазы можно использовать 5-10%-й раствор трихлоруксусной кислоты. Необходимость обработки параллельных препаратов нуклеазами связана с тем, что эти красители не специфичны для нуклеиновых кислот и могут связываться другими веществами. Так, пектиновые вещества могут также окрашиваться пиронином.
Для изучения локализации нуклеиновых кислот применяют люминесцентный метод с использованием красителя акридина оранжевого. Этот краситель при низких концентрациях и определенном рН связывается с ДНК с образованием мономеров» окрашенных в зеленый цвет, а с РНК - с образованием красных димерных катионов, что обусловливает различное свечение этих кислот в ультрафиолетовом свете.
Для изучения растительных объектов после их фиксации по Карнуа иногда применяют методику Берталанфи. При этом депарафинированные срезы быстро проводят через растворы спирта (80, 70, 50%-й), дистиллированную воду, 1%-й раствор уксусной кислоты и снова через дистиллированную воду, а затем окрашивают в 0,01 %-м растворе акридина оранжевого в течение 3 мин. Раствор акридина оранжевого вначале готовят в концентрации 0,1%, а перед употреблением разводят до 0,01% фосфатным буфером с рН 6. После окраски объект переносят на одну минуту в фосфатный буфер с рН 6 и дифференцируют в 0,1 М СаС12 1-2 мин, ополаскивают фосфатным буфером, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом Люмам в сине-фиолетовом свете. Ядра клеток светятся ярко-зеленым, а ядрышки - желтовато-красным светом.
Для выявления основных белков (гистонов) используют специфический краситель прочный зеленый (фастгрюн).
Объекты после фиксации в 10%-м растворе формалина в течение 3-6 ч промывают в проточной воде 10-12 ч, обезвоживают и по обычной методике парафинируют. Краситель готовят, растворяя 100 мг прочного зеленого в 10 мл воды, и доводят рН до 8. Перед окрашиванием срезы помещают в 5%-й раствор трихлоруксусной кислоты на 15 мин при 100°С для удаления нуклеиновых кислот, которые могут маскировать окраску на белки. Последовательность работы следующая.
Депарафинированные срезы доводят до воды (см. с. 86).
Обрабатывают срезы трихлоруксусной кислотой.
Промывают срезы в 70%-м растворе этилового спирта, а затем в воде.
Переносят срезы в краситель на 20 мин при 22°С.
Последовательно переносят срезы в воду, в 96%-й раствор спирта, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
На препаратах основные белки окрашиваются в изумрудно-зеленый цвет.
Для одновременного выявления белков и углеводов применяют свежеприготовленные проционовые красители. Работу выполняют в следующей последовательности.
Депарафинированные срезы доводят до воды.
Окрашивают срезы 0,1%-м раствором проционового ярко-голубого RS в фосфатном буфере при рН 5,6-6 и температуре 55-60 °С в течение часа.
Тщательно промывают срезы в дистиллированной воде.
Окрашивают срезы 0,1%-м раствором проционового ярко-красного 2BS в 1%-м растворе соды (рН 10,5) в течение 20 мин при комнатной температуре.
5. Срезы промывают водой, обезвоживают, переносят в ксилол и заключают в бальзам.

Монтирование препаратов
Предметные стекла со срезами вынимают из ксилола пинцетом, вытирают с нижней стороны и кладут на ровную поверхность, покрытую белой бумагой. Затем быстро, не допуская подсыхания срезов, капают сверху одну каплю канадского бальзама и каплю чистого ксилола. Берут чистое покровное стекло, ставят его наклонно на предметное, касаясь бальзама, и осторожно опускают. Справа и слева от покровного стекла кладут кусочки фильтровальной бумаги, для удаления излишков ксилола и бальзама. Затем препарат осторожно вытирают тряпочкой, смоченной в ксилоле, и сушат в течение нескольких дней. Иногда на препараты сверху накладывают небольшие гирьки массой 5-10 г для удаления пузырьков из-под покровного стекла.
После сушки препарат окончательно протирают, просматривают под микроскопом и подписывают. На левой стороне его ставят очередной номер, который заносят в специальный каталог с указанием способа окраски и номера по журналу фиксации.
На правой стороне препарата наклеивают этикетку с указанием названия препарата, например: «Двойное оплодотворение мягкой пшеницы». Дробью указывают отмеченный срез на препарате. Например, 2/г, т. е. второй срез во втором ряду. Иногда срезы отмечают тушью с нижней стороны препарата. Готовые препараты хранят в специальных коробках.
ПОСТОЯННЫЕ ГЛИЦЕРИНОЖЕЛАТИНОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Для анатомических исследований в тех случаях, когда возникает необходимость быстро приготовить постоянный препарат, например с пыльцевыми зернами или прорастающими пыльцевыми трубками в пестиках пшеницы, ржи или других растений, объекты можно заключить в глицерииожелатин.
Приготовление глицериножелатина. Вносят 1 г желатина и 6 мл дистиллированной воды в небольшую колбу. Желатин набухает несколько часов. После этого в колбу добавляют 7 мл очищенного глицерина и кристаллик антисептика. Колбу ставят иа горячую водяную баню. Содержимое ее помешивают стеклянной палочкой. Через некоторое время смесь, в колбе разжижается. Ее переносят в термостат и фильтруют через бумажный фильтр в горячем виде.
Глицериножелатин может долго храниться в закрытой склянке с корковой пробкой, в которую вставлена стеклянная палочка. При необходимости склянку с глицериножелатином помещают в воду, подогреваемую на водяной бане. Глицериножелатин ,разжижается, и его используют для приготовления препаратов.
В качестве фиксирующей и просветляющей жидкости берут лактофенол Аммана. В его состав входят 1 ч. молочной кислоты, 1 ч. фенола, 2 ч. глицерина и 1 ч. воды. Красителем служит 1%-й раствор хлопчатобумажного синего, который добавляют в лактофенол.
Последовательность изготовления препаратов. Рыльце с проросшими пыльцевыми зернами помещают на предметное стекло, на которое наносят смесь лактофенола и красителя. Продолжительность одновременной фиксации и окраски 5-10 мин, затем пипеткой удаляют смесь и наносят чистый лактофенол для дифференцировки препарата. После окончательного удаления лактофенола наносят по капле теплого глицериножелатина на предметное и покровное стекла. Смонтированный препарат быстро застывает. Такие препараты сохраняются от одного года до нескольких лет.
При изготовлении глицерииожелатиновых препаратов можно воспользоваться насыщенным раствором метилового зеленого в 50%-м растворе спирта или водным раствором основного фуксина (1 г на 10 мл воды). Любой из этих красителей прибавляют к горячему глицериножелатину (20 капель фуксина на 15 мл глицериножелатина). Пыльцу помещают в центр предметного стекла и для просветления ее прибавляют 6-8 капель спирта для энтомофильных растений и 1-2 капли - для анемофильных. Затем добавляют каплю горячего глицериножелатина с красителем и помешивают пыльцу иглой. Чтобы среда быстро не застыла, стекло проносят над пламенем спиртовки.
В 1965 г. И. Д. Романов применил для изучения пыльцы картофеля следующую методику. Он окрасил сухую пыльцу из пыльников на предметном стекле 0,1%-м спиртовым раствором основного фуксина, который затем отмывал 1-2%-м раствором соды. Влажную окрашенную пыльцу заключал в глицериножелатин.
Глицериножелатиновые препараты широко применяют в анатомических исследованиях, при которых срезы желательно оставить неокрашенными или не проводить через спирты. Окрашенные в глицериножелатине такие срезы быстро обесцвечиваются. В ряде случаев при использовании метиленовой синей, кристаллвиолета, фуксина и других красителей удается сохранить окраску.
Например, чтобы изготовить глицериножелатиновые препараты для наблюдения плазмодесм в порах клеточных стенок у созревающих семян плодовых и во время выхода семян из покоя с использованием кристаллвиолета, Е.3. Окнина и Е.Н. Барская в 1956 г. готовили следующие реактивы:
первый р-р Люголя, состоящий из 0,75 г йодида калия и 1 г металлического йода, растворенных в 100 мл воды;
два раствора серной кислоты 10%-й и 5%-й;
второй раствор Люголя, состоящий из 1,25 г йодида калия и 1 г металлического йода, растворенных в 100 мл 5%-го раствора серной кислоты;
краситель - 1%-й водный раствор кристаллвиолета, который по каплям приливают к двум-трем каплям 5%-го раствора серной кислоты, пока она не окрасится в темно-зеленый цвет;
закрепляющий раствор, состоящий из 30 мл глицерина, 2 г хлорида цинка, 0,2 г металлического йода и 80 мл воды со следами йодида калия.
Последовательность работы следующая.
Свежие срезы помещают в первый раствор Люголя на 5 мин.
Переносят срезы в 10%-й раствор серной кислоты на 5 мин, а затем во второй раствор Люголя на 5 мин.
Промывают срезы 5%-м раствором серной кислоты 3 раза, до исчезновения желтой окраски.
Переносят срезы в краситель на 15-20 мин до просветления его окраски, а затем в закрепляющий раствор.
Просматривают срезы в глицерине или глицериножелатине.
ВРЕМЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ. ПЕРЕВОД ИХ В ПОСТОЯННЫЕ
Фиксация, хранение и мацерация объектов
В микроскопической технике широко применяют временные давленые препараты, для изготовления которых не нужны сложная процедура обезвоживания, заключение в промежуточную жидкость, в парафин и получение микротомных срезов.
Давленые препараты необходимы при изучении митоза, кариотипов, хромосомных нарушений в корешках и конусах нарастания стеблей, мейоза в молодых пальниках.
Наиболее часто для изготовления давленых препаратов используют фиксаторы Кариуа (6:3: 1), Ныокомера (6:3:1:1:1), Баталья (5:5:1:1), уксусный алкоголь (3: 1), ледяную уксусную кислоту и др. Когда трудно считать хромосомы или они длинные, применяют специальные методы предобработки, о которых было сказано выше (см. с. 60). Так, для кариологического анализа корни скерды зеленой перед фиксацией обрабатывают 0,05%-м раствором колхицина обычно в течение 2 ч. Кроме колхицина, можно брать насыщенные растворы парадихлорбензола или 0,002 М 8-оксихинолина. Эти два раствора готовят в термостате при 60°С. Для предобработки корней перед фиксацией хорошие результаты дает насыщенный в воде раствор монобром-нафталина. Для подсчета числа хромосом возможна фиксация корней при пониженной температуре (2-3°С).
Фиксированный материал хранят в холодильнике в фиксаторе или промывают в 96%-м растворе этилового спирта и хранят в 70%-м его растворе до окрашивания.
При изготовлении давленых препаратов исключительное значение имеют способы мацерации тканей до окрашивания (лат. maceratio - размягчение; в данном случае обработка объекта, чтобы вызвать распад ткани на отдельные клетки). Обычно для этого используют 45%-ный раствор уксусной кислоты (для твердых объектов ее подогревают), 40-45%-й - пропионовой кислоты, 1 н. раствор соляной кислоты, различные энзимы (пектиназа, цитаза) и др. Окрашивают препараты ацетокармином, ацетоорсеином, пропионовым гематоксилином и др.
Ниже приведены наиболее распространенные методы приготовления красителей и окрашивания давленых препаратов.
Окрашивание препаратов
Окрашивание ацетокармином, ацетоорсеином, ацетолакмоидом и метиленовой синей.
Приготовление красителей.
Ацетокармин. Наиболее распространен следующий метод. Растворяют 1 г (лучше 2-4 г) кармина - красящего вещества, состоящего из карминовой кислоты, - в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение ведут в колбе с обратным холодильником на водяной бане с подогревом около 3 ч. При отсутствии обратного холодильника в колбу вставляют воронку. После остывания темно-красный раствор кармина фильтруют и помещают в посуду с притертой крышкой. Для работы его наливают в капельницы. Остатки кармина на фильтре можно использовать повторно.
Можно готовить кармин по методу Сноу на этиловом спирте с добавлением НС1. Для этого 4 г кармина сначала растворяют в 15 мг горячей воды и добавляют 1 мл HG1. Остывшую смесь разбавляют 95 мл 85%-го раствора спирта и фильтруют.
Ацетоорсеин. Готовят орсеин из орсина - красящего начала природной краски, получаемой из лишайника. Растворяют 1 г орсеина в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавляют 55 мл дистиллированной воды, кипятят на водяной бане 3 ч, остужают и после фильтрации раствор готов к употреблению.
Ацетолакмоид. Растворяют 2 г лакмоида в 100 мл 45%-го раствора уксусной кислоты и кипятят 2 ч в колбе с обратным холодильником. После испарения добавляют уксусную кислоту до первоначального объема. Раствор используют после фильтрации.
Метиленовая синяя. 100-500 мг краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
При использовании всех этих красителей в качестве фиксатора для корней чаще всего применяют уксусный алкоголь (3: 1). Если для окрашивания берут ацетоорсеин, ацетокармин или ацетолакмоид, объекты помещают в раствор одного из них, подогревают на спиртовке, доводят до легкого кипения несколько раз, особенно если не была проведена мацерация в НС1.
Корни злаков труднее окрашиваются и мацерируются, поэтому приходится увеличивать время их окрашивания. Так, корни ячменя, пшеницы иногда выдерживают в ацетоорсеиие от.одних до полутора суток при комнатной температуре.
После этого объект кладут на предметное стекло в каплю 45%-го раствора уксусной кислоты или хлоралгидрата (5 г хлоралгидрата растворяют в 2 мл дистиллированной воды), отделяют конус нарастания, удаляют лишние ткани, накрывают покровным стеклом и фильтровальной бумагой и постукивают сверху спичкой, чтобы уложить клетки конуса нарастания в виде монослоя.
Описанный метод приготовления красителей и препаратов применяют в различных модификациях. Так, можно сохранять фиксированный материал в свежем фиксаторе при температуре 0-3°С, а окраску и мацерацию объектов вести в смеси растворов 2%-го ацетоорсеина и 1 н. НС1 в соотношении 9:1 при подогревании или воспользоваться 4%-м ацетолакмоидом и 1 н. НС1 (9:1) для мацерации и окраски с последующим перенесением объектов в ацетолакмоид. В некоторых случаях фиксированный материал сохраняют в 70%-ном растворе спирта при температуре 0-3°С и окрашивают в ацетокармине с добавлением железа.
Иногда материал мацерируют не в соляной кислоте, а в ацетокармине или ацетоорсеине, в которых его оставляют на ночь. В ацетолакмоиде материал можно держать двое суток, например корни гречихи.
Готовые препараты можно окантовать расплавленным парафином или превратить в постоянные при помощи сухого льда или жидкого азота (см. с. 103).
Пропионово-гематоксилиновый метод окрашивания по Henderson и Lu. Перед окрашиванием объект мацерируют в 1 н. растворе НС1 от нескольких до 30 мин, промывают водой и на несколько минут помещают в 50%-ный раствор пропионовой кислоты.
Приготовление красителя. Растворяют 4 г гематоксилина в 10 мл 96%-го раствора этилового спирта, затем добавляют дистиллированную воду до 100 мл. Раствор оставляют открытым при комнатной температуре для созревания на 2-3 мес. Для ускорения созревания сосуд с раствором красителя можно поставить в термостат при 30-35 °С на сутки. Созревший раствор смешивают со 100 мл 50% -го раствора пропионовой кислоты. Допускается смешение свежего раствора с пропионовой кислотой.
Отдельно готовят раствор железоаммоиийных квасцов в пропионовой кислоте. Для этого 1 г квасцов растворяют в 200 мл 50%-го раствора пропиоиовой кислоты.
Известны четыре способа окрашивания. Приведем два из них. Первый способ используют при наличии незрелого раствора кра сителя: последний смешивают с квасцами (1:1) и используют через сутки или более. При втором способе к 1-2 каплям созревшего красителя добавляют квасцы (1 : 1) и помещают в эту смесь объект на предметное стекло.
Добавление насыщенного раствора ацетата железа в 50%-м растворе пропионовой кислоты способствует усилению окрашивания. Метод применялся для изучения хромосом льна, но используется и в работе с другими объектами.
Окрашивание ацетофуксином. Окрашивают объекты в ацетофуксине в закрытых бюксах в течение 1-3 ч. Давленый препарат готовят в 30%-й уксусной кислоте, которая способствует обесцвечиванию цитоплазмы. Хромосомы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет.
Приготовление красителя. Растворяют 1 г основного фуксина в 50 мл 40%-го раствора уксусной кислоты. Раствор подогревают до 50°С для хорошего растворения фуксина, затем охлаждают до 25-30 °С и фильтруют. Объекты фиксируют в 45%-м растворе уксусной кислоты 10-30 мин при 15 °С. Затем помещают в горячий 1 н. раствор HCI на 15-30 с при 60°С.
Пропионово-л акмоидный метод окрашивания по Каптарю. Кончики корней длиной 2-4 мм помещают в пробирку с 510 каплями стандартного раствора на 12 ч. Затем корни переносят в 0,5 мл 40%-ного раствора пропионовой кислоты, которую доводят до кипения в течение не более 530 с для мацерации объекта. После кипения корни переносят на предметное стекло в каплю 40%-го раствора пропионовой кислоты, накрывают покровным стеклом и давят на него. Подсчитывать хромосомы удобнее в корне не в зоне интенсивного деления, а в тех клетках, которые делятся тангентально и поэтому более удобны для подсчета. Они располагаются обычно по периферии препарата.
Приготовление красителя. Для окрашивания временных препаратов с корнями или пыльниками растений готовят смесь такого состава: 5 г лакмоида добавляют к 50 мл 50%-го раствора пропиоповой кислоты. Полученный раствор ставят в темное место на 3-5 сут и время от времени встряхивают. Затем его фильтруют и используют в работе как стандартный раствор. Отдельно готовят 40%-й раствор пропионовой кислоты.
Хромосомы окрашиваются при таком способе в коричневый цвет. Контрастность хромосом увеличивается спустя полчаса после приготовления препарата.
Окрашивание реактивом Шиффа. Известны две модификации реакции Фёльгена для выявления ДНК: с холодным и горячим гидролизом объектов в соляной кислоте.
Приготовление красителя. При холодном гидролизе реактив Шиффа составляют из 97,5 мл дистиллированной воды, 2,5 мл концентрированной соляной кислоты, 0,5 г фуксина основного для фуксииосернистой кислоты, 1,5 г метадисульфита калия (K2S2O5) или натрия (Na2S2O5). Составные части вносят в сосуд в указанном порядке без взбалтывания. Закрытый сосуд с реактивом помещают в темное место на двое суток для обесцвечивания раствора.
Подлежащий окраске материал из фиксатора или 70%-го раствора спирта переносят в I н. раствор НС1, а затем в разбавленную соляную кислоту (1 ч. концентрированной HCl-f-1 ч. дистиллированной воды) при комнатной температуре. Время гидролиза корней в HCI от 20 мин (для гороха) до 2 ч (для картофеля). В реактиве Шиффа корни держат 15 мин и более. Потом их переносят в 45%-й раствор уксусной кислоты. Готовят препарат в той же концентрации уксусной кислоты.
При горячем гидролизе реактив Шиффа готовят по методу. указанному выше. Порядок работы при этом способе следующий.
Материал из 70%-го раствора спирта сначала переносят на несколько секунд в холодный раствор 1 н. НС1, затем на несколько минут в раствор 1 н. HCl с температурой 60°С для горячего гидролиза (6-8 мин - для фиксатора Карнуа или уксусного алкоголя).
Снова переносят материал в холодный 1 н. раствор НСl на несколько секунд.
Переносят материал в реактив Шиффа на 0,5-1,5 ч (время устанавливают опытным путем).
Промывают материал в трех сосудах с сернистой водой по 5-10 мин в каждом.
Промывают материал в проточной воде, а затем в 40-45%-м растворе уксусной кислоты.
Готовят давленые препараты.
Переносить корни или пылинки из одной жидкости в другую удобно в небольших стеклянных цилиндрах без дна, затянутых с двух концов марлей.
После окрашивания реактивом Шиффа может возникнуть необходимость провести мацерацию растительных объектов. В этом случае, помимо уксусной кислоты, пользуются цитазой из зобной жидкости виноградных улиток.
Зобную жидкость извлекают из улиток Helix lucorutn iaurica, убитых быстрым замораживанием. Очищают ее центрифугированием при 20 тыс. оборотов в минуту в течение 30 мин и хранят в замороженном состоянии при -4°С. Корни, окрашенные по Фёльгену, помещают сначала на фильтровальную бумагу, а затем в плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл. В пробирки добавляют цитазу по 0,05 мл на 10 корней (кормовых бобов). Мацерация длится 20 ч при комнатной температуре.
Окрашивание нигрозином. Используют следующую методику мацерации и окрашивания объектов. Готовят смесь концентрированной соляной кислоты и 95%-го раствора этилового спирта (соотношения 1:4, 1:2, 1:1, в зависимости от материала; для нежных объектов - 1:4). В мацерирующую жидкость при 10-15°С помещают объекты на 5-20 мин. После промывки в охлажденной воде в течение 30-120 мин их переносят на предметное стекло в каплю 4%-ного раствора нигрозина при температуре 18-20 °С на 2-3 мин.
Приготовление красителя. Готовят нигрозин растворением в кипящей дистиллированной воде. Раствор кипятят 5-7 мин и фильтруют в темноте. Через 10-14 дней краситель готов.
Ускоренный метод приготовления давленых препаратов
Фиксируют материал по Дайеру в смеси этилового спирта, уксусной кислоты, хлороформа и формалина (10:2:2:1) в течение 5 мин.
Мацерацию проводят в растворе 1 н. НС1 при 60°С в течение нескольких минут в зависимости от объекта. Окрашивают объект 2-3 мин в смеси орсеина, молочной и пропионовой кислот. Для этого 2 г орсеина растворяют в 100 мл смеси, состоящей из равных частей молочной и пропионовой кислот, добавив до 45% воды.
Приготовление препаратов из стеблевой меристемы
У злаков корни трудно раздавливаются, а цитоплазма клеток нередко сильно окрашивается ацетокармином. В таких случаях изучение митозов и хромосом можно проводить на стеблевой меристеме.
Колеоптиле (до 1 см) проросшего семени твердой пшеницы обрабатывают по методике Маккья не менее 3 ч 0,3%-м раствором колхицина и насыщенным раствором парадихлорбензола. Фиксируют проростки в уксусном алкоголе (3:1). Затем материал проводят через серию растворов спирта (80, 50, 30%-й), промывают в воде и красят реактивом Шиффа (см. с. 101).
При изучении действия мутагенов на пшеницу в Институте химической физики АН СССР было предложено проводить исследования во время первых митозов в конусе нарастания стебля в фазе колеоптиле.
Порядок работы следующий. Зерновки пшеницы замачивают и ставят в термостат при 25 °С. Через 36-40 ч колеоптиле с щитком семени фиксируют в уксусном алкоголе в течение 12 ч. Материал хранят в 70%-м растворе спирта со следами цитрата железа. Окрашивают в ацетокармине. Материал можно оставлять на ночь в красителе или .нагревать в нем в течение 5-6 мин до легкого вскипания. В 45%-м растворе уксусной кислоты отделяют конус нарастания и раздавливают его под покровным стеклом'. Метод используют для изучения хромосомных перестроек в анафазе и митотической активности клеток под действием мутагенов.
Приготовление препаратов из молодых листочков
Фиксируют молодые листочки в фазе наиболее сильного роста. В качестве фиксатора используют уксусный алкоголь. Промывают и сохраняют материал в 70%-м растворе спирта. Для окрашивания листочки помещают в краситель (ацетокармин, ацетоорсеин или ацетолакмоид) и доводят до кипения несколько раз. Затем их переносят в 45%-й раствор уксусной кислоты па предметное стекло. От листочка отделяют основание, так как здесь чаще встречаются митозы, а остальную часть удаляют. Основание листочка разрезают на стекле, накрывают объект покровным стеклом и постукивают спичкой сверху. Метод используют в работе со злаками и картофелем. Можно обрабатывать листочки перед фиксацией 0,2%-м раствором колхицина в течение 1-2 ч.
Для изучения хромосом перед фиксацией молодые листочки помещают в насыщенный раствор эскулииа на 15-24 ч при 10-12°С, а затем фиксируют в уксусном алкоголе от 3 до 24 ч.
Для окраски и мацерации объекты помещают в смесь 2%-го раствора ацетоорсеииа с 1 н. НС1 (9:1), подогревают на спиртовке 3-4 с и оставляют в смеси на 30 мин при 30°С. После этого объекты .переносят в 1%-й раствор ацетоорсеина на предметное стекло и раздавливают под покровным стеклом.
Перевод временных препаратов в постоянные
Существует несколько методов перевода временных препаратов в постоянные. Наиболее широко распространен метод с использованием твердой угольной -кислоты по Конжеру и Ферчайльду. Готовый давленый препарат кладут на ровную поверхность сухого льда на 1-1,5 мин. Покровное стекло становится неподвижным. Скальпелем или лезвием бритвы отделяют его от предметного. Клетки должны остаться на предметном стекле, которое затем последовательно выдерживают по 2-5 мин в 50, 70, 80, 96%-х растворах этилового спирта, абсолютном спирте и в ксилоле. При отсутствии 100%-го этилового спирта можно использовать бутиловый или изобутиловый спирт. Перед ксилолом иногда вводят смесь абсолютного этилового спирта и ксилола. После ксилола препарат заключают в канадский бальзам, используя чистое покровное стекло.
Многие лаборатории применяют для превращения давленых препаратов в постоянные метод с жидким азотом. Для этого в сосуды с жидким азотом вставляют алюминиевый стержень, имеющий небольшой столик. Столик быстро охлаждается, и на его поверхность кладут препараты. В дальнейшем, так же как это было описано выше, отделяют покровное стекло, а предметное стекло проводят последовательно через серию жидкостей, затем препарат заключают в бальзам.
Если нет сухого льда и жидкого азота, для отделения покровных стекол можно воспользоваться более простой методикой. Для ацетокарминовых препаратов берут 10%-й раствор уксусной кислоты. Наливают ее в чашку Петри, кладут туда две спички и на них помещают препарат покровным стеклом вниз. Через 10-15 мин покровное стекло отделяется, Предметное стекло быстро опускают в фиксатор - уксусный алкоголь, а затем последовательно в абсолютный спирт, ксилол и заключают в бальзам. Этот метод применяют в различных модификациях.
После окрашивания препаратов по Фёльгену и отделения покровного стекла препарат обезвоживают последовательно в крепких спиртах и проводят через ксилол перед заключением в бальзам (см. с. 103).
Существует методика перевода временных препаратов в постоянные без удаления покровного стекла путем пропускания с одной стороны покровного стекла и отсасывания с помощью фильтровальной бумаги с другой его стороны последовательно разных растворов: 45%-го раствора уксусной кислоты, смеси спирта и уксусной кислоты (1:2), абсолютного спирта. Можно также последовательно провести спирты разной концентрации, а затем ксилол и бальзам. Эту методику применяют в работе с ацетокарминовыми препаратами.
Наиболее просто можно заключить гистологические срезы в сахарный сироп по методике Шалумовича. Метод применяют в работе с ботаническими объектами, в том числе для флуоресцентной микроскопии. Растворяют 25 г сахара в 50 мл горячей воды и выпаривают до ѕ объема на водяной бане. После закипания раствора его фильтруют и добавляют кристаллик антисептика - тимола. Полученный сироп в различных модификациях используют для быстрого изготовления постоянных препаратов. К окрашенному объекту после удаления избытка красителя с помощью фильтровальной бумаги добавляют каплю сиропа сбоку покровного стекла или раздавливают объект в капле сиропа. Препарат исследуют сразу или подсушивают его до превращения в постоянный.
Для превращения временных давленых препаратов в постоянные в лабораторной практике можно использовать термоэлектрические охлаждающие столики - приспособления к замораживающему микротому (рис. 34). Они позво

Рис. 34. Термоэлектрический охлаждающий столик (ТОС):
1 - рабочая охлаждающая поверхность; 2 - корпус; 3 - штуцер для подключения воды; 4 - клемма для подключения электрического тока.

1. Правила гербаризации растений
Гербарий (лат. herba – трава) – это коллекция правильно собранных, высушенных, определенных, смонтированных растений, снабженных этикеткой. Гербарные образцы необходимы для изучения морфологических особенностей растений, экологии и географии видов, для точного установления таксономической принадлежности растений.
Простейшее оборудование для сбора гербария
Бумага. Для сбора растений, а затем для их сушки используют непроклеенную газетную, оберточную, фильтровальную бумагу. Ее складывают в виде тетрадок. Чтобы растения не выпадали, сложенный лист должен иметь клапан. Размер сложенного листа 45x30 см. Для сбора и засушивания 50 видов растений необходимо иметь 100-150 листов.
Гербарная папка. Она состоит из двух кусков плотного картона размером 49х32 см. В каждой из двух створок по четыре прорези. Через них продета широкая тесьма, настолько длинная, чтобы не только соединить створки папки, но и дать возможность надеть папку на плечо.
Перед выходом на экскурсию в папку кладут заранее приготовленную бумагу для закладки растений. Для одной экскурсии надо взять около 30 листов.
Копалка. Это узкая стальная лопатка или стамеска шириной 2,6-3 см. Копалки используют для выкапывания растений с корнями.
Пресс. Он состоит из двух рамок размером 50х35 см, на которые натянута сетка из тонкой проволоки с ячейками 1-3 см. Растения спрессовывают между этими сетками при помощи прочной веревки, завязанной особым способом.
Этикетка. Лист чистой бумаги размером 14х6 см. Черновые этикетки вкладывают в бумагу вместе с растением на месте сбора. В лаборатории к готовому гербарному листу приклеивают постоянную аккуратно написанную чернилами этикетку.
Кроме названного основного снаряжения, необходимо также иметь перочинный или садовый нож, компас, карту местности, лупу с увеличением в 3-5 раз, несколько пакетов для сбора плодов и семян.
Кроме оборудования необходимо иметь с собой пачку небольших листочков бумаги для составления черновых этикеток, карандаш и записную книжку.
Поскольку точное определение таксономической принадлежности растения невозможно или крайне затруднительно, если отсутствуют его генеративные органы, то гербаризировать цветковые растения нужно в фазу цветения или плодоношения (лучше с цветками и плодами), споровые растения – со спороносными органами, голосеменные – с шишками (главным образом, женскими).
Сбор.
Сбор растений для гербария проводят в сухую погоду. Мокрые экземпляры плохо сохнут и теряют естественную окраску. Поэтому нельзя проводить сбор сразу же после дождя или рано утром, когда растения покрыты росой. Собирают только нормально развитые растения (недоразвитые или поврежденные для гербария не берут).
Растение в момент сбора обязательно должно иметь не только вегетативные органы, но и репродуктивные – цветки или плоды или те и другие. Некоторые виды растений, например из семейств: капустные, сельдерейные, астровые, осоковые, необходимо собирать с плодами, так как у их представителей структура цветка сравнительно однообразна и важнейшие диагностические признаки содержат плоды. Травянистые растения собирают с подземными органами – корнями, корневищами, луковицами и т. д.
После выкапывания осторожно пальцами разминают землю на корнях растения, стряхивают ее и сразу же закладывают экземпляр в бумагу. На бумаге растение расправляют, чтобы отдельные органы не лежали друг на друге. Цветки укладывают так, чтобы одни были сложены, а другие – развернуты. Части растения не должны высовываться из бумажного листа, а тем более из папки. Та часть растения, которая выступает за края папки, будет подсыхать быстрее, в результате гербарное растение будет иметь неодинаковую окраску.
Вместе с растением в гербарный лист кладут заполненную черновую этикетку. В ней карандашом подробно указывают место сбора растения (ближайший населенный пункт, район, область), местообитание (сообщество – лес, болото, луг; рельеф – плоский водораздел, склон оврага, горы и его экспозиция, западина и т. д.; субстрат – каменистое обнажение, песок и т. д.), степень распространения (единично, группами; редко, обильно), а также дату сбора.
Небольшие растения можно вкладывать в каждый гербарный лист по нескольку штук, но они должны быть одного и того же вида и собраны в одном и том же месте обитания. Если растение крупное и не входит в стандартный гербарный лист даже в согнутом виде, то в гербарий берут отрезки разных частой – корень с базальной частью стебля и листьями низовой формации, среднюю часть стебля с листьями срединной формации и верхнюю часть стебля с цветоносными или плодоносящими побегами. Отдельные части одного растения можно закладывать в разные листы, пронумеровав их, а затем обернув одним общим листом.
При сборе водных и болотных растений необходимо корни тщательно промыть, отжать воду, обтереть досуха остальные органы, а затем уже закладывать в бумагу.
При сборе в гербарий древесных растений берут с дерева или кустарника цветущие побеги. Если растение цветет до появления листьев, то позже собирают в гербарий побеги с листьями, а впоследствии желательно и с плодами.
Студентам не следует увлекаться сбором сельскохозяйственных и декоративных растений для учебных целей, так как сортовое разнообразие по обычным определителям установить нельзя.
Одновременно собирают растения для гербария и для определения. Во втором случае материал хранят в полиэтиленовом или бумажном пакете.
В каждый гербарный лист должна быть вложена черновая этикетка, на которой как можно точнее указан географический пункт сбора (например, «в 2-3 км к югу от с. Киреевского») и местообитание собранного растения (например, «по опушке соснового леса»). Далее указывается дата сбора и кем собран. На этикетке ставят порядковый номер. Если гербарные образцы не этикетированы сразу же при сборе гербария, они теряют научную ценность.
В записную книжку записывают номер этикетки и признаки растения: окраска венчика у живых цветков (при сушке она часто существенно изменяется), окраска листьев, цвет коры у древесных растений и др. Отмечается также частота встречаемости и местообитания образца.
Если растение редкое, занесено в «Красную книгу», выкапывать его для гербаризации недопустимо. Необходимо только описать как можно точнее морфологические признаки этого растения (форма листьев, окраска и строение цветка, плода), зарисовать их, сфотографировать. Кроме того, записать географический пункт и местообитание растения, единичными экземплярами растет или группами. Собранный гербарий обязательно в тот же день должен быть заложен в прессы для сушки.
Засушивание
После возвращения в лабораторию растения, предназначенные для определения, ставят в воду, а собранные для гербария перекладывают из папки в пресс. Одну рамку пресса надо положить сеткой вверх, а на нее два-три пустых листа бумаги. Сверху укладывают уже листы с растениями. Перед закладкой в пресс материал необходимо просмотреть еще раз и, если нужно, вновь расправить листья и цветки. Налегающие друг на друга части растения надо переложить полосками бумаги. Эту работу проводят особенно тщательно, так как от нее зависит качество гербарных растений.
Сочные подземные органы (луковицы, клубни, корневища) перед укладкой в гербарный лист разрезают вдоль, а сочные растения, например из родов: заразиха, очиток и другие, а также хвойные желательно опустить в кипяток, а затем убрать лишнюю воду фильтровальной бумагой.
Чтобы влажность от одного гербарного листа с растением не передавалась другому, их разделяют двумя-тремя пустыми листами бумаги – прокладками. Стопка гербарных листов в прессе не должна превышать в толщину вместе с прокладками 15-20 см. На последний гербарный лист кладут два-три пустых, закрывают стопку второй рамкой пресса и стягивают веревкой. В сухую погоду пресс выставляют на солнце или вешают под навесом на хорошо продуваемом месте.
Через сутки делают первую перекладку гербария: развязывают пресс, вынимают отсыревшие прокладки и заменяют их на сухие. После смены прокладок гербарий опять туго затягивают в пресс. Сырую бумагу просушивают и используют при следующей перекладке. Такой просмотр со сменой прокладок осуществляют ежедневно в течение трех-четырех дней, в дальнейшем – один раз в двое-трое суток. Приблизительно через трое суток, когда растения немного подсохли, можно ослабить веревку на прессе, чтобы воздух проходил между листами гербария. Пересушивать растения нельзя, так как они становятся очень ломкими.
Высушенный материал при прикосновении к щеке или губам кажется теплым, недосушенный испаряет влагу и поэтому ощущается как холодный. Конец сушки можно также определить, приподняв растение. Если все его органы располагаются горизонтально, то гербарный материал готов, если свешиваются, то он еще сырой.
Сухой гербарий нужно правильно упаковать. Для этой цели гербарные листы укладываются так, чтобы поверхность пачки была горизонтальной (для этого можно чередовать листы, в которых растения положены вниз корневой системой, и листы, в которых растения положены вверх корневой системой). В пачку складывается 30-35 гербарных листов. Пачки упаковываются в 4 гербарных листа, так что растения надежно закрыты с боков, сверху и снизу и перевязываются шпагатом. В таком виде гербарий хранится до конца практики и транспортируется по ее окончании.
1. Различные способы засушивания растений
Для получения гербарного образца растения, обладающего и научными, и художественными качествами, с сохранением природной окраски его, применяют несколько способов:
засушивание в листах пористой бумаги под прессом, между досками («холодная» засушка);
засушивание в листах пористой бумаги (с ватным настилом или без него), заложенных в гербарные рамки, – на солнцепёке, в печке, в термостате или в сушильном шкафу (так называемая «горячая» засушка);
засушивание в песке.
Засушивание в песке для получения не плоскостной, а объёмной засушки, проводимое в ящиках с прокалённым и просеянным песком, неприменимо во время путешествий, передвижения с места на место, а оформление и хранение засушенных экземпляров в стеклянных ящиках сопряжено с большими затратами и неудобствами.
Чтобы засушить цветы в песке, нужно взять ящик с выдвижной крышкой и дном и непосредственно под крышкой укрепить натянутое на рамке проволочное сито, соответствующее величине ящика. Затем взять песок, очистить его, просеять, просушить и нагреть в котелке. К песку, беспрерывно мешая, прибавить стеарина в количестве 10 г на 1 кг песку. Готовый ящик поставить крышкой вниз, насыпав в него слой тёплого песку, расположить растение горизонтально или вертикально и подсыпать столько песку, чтобы растение, оставаясь неподвижным, было покрыто им, затем вынутое дно вставить обратно и поставить ящик в печь или термостат с температурой +50-60°С; засушивание в такой температуре через 3 дня можно считать законченным. Тогда надо вынуть из печи ящик, осторожно выдвинуть крышку, через которую высыпается песок, и растение окажется сухим, сохранив форму и цвет.
Летом ящики с заложенными в песке растениями можно ставить для засушки на чердак под раскалённую железную крышу.
Растения «объёмного засушивания» можно с успехом использовать для букетов в зимнее время.
Наиболее результативным, скорым и дешёвым способом засушивания растений с сохранением цвета является засушивание в гигроскопической вате, подложенной в листы пористой бумаги, которые закладывают в гербарные рамки, помещаемые для просушки на солнцепёке или в печи с температурой + 35-50°С.
2. Сбор растений для засушивания
Растения для засушивания собирают на полях, лугах, в лесах, на горах, в долинах, болотах и т. д., в зависимости от целей гербаризации. Когда это нужно, растения собирают в разных фазах развития: молодые всходы, взрослые растения до зацветания, в цвету, с созревшими семенами.
Гербарные экземпляры должны давать полное и всестороннее понятие о растениях, а потому на них обязательно должны быть зафиксированы не только надземные органы растений, но и находящиеся под землёй (корни, корневища, луковицы).
У вьющихся растений для засушивания берут наиболее типичную, соответствующую размерам гербарного листа, часть стебля с листьями, цветками .и плодами.
У древесных пород и кустарников для засушивания срезают типичные ветки с листьями и соцветиями. Если растение имеет раздельнополые цветки, нужно взять ветви и с мужскими и с женскими соцветиями. У двудомных растений придётся для этого брать ветки с разных экземпляров. У хвойных пород также срезают ветки с мужскими и женскими шишками, чтобы хвоя после засушивания не опадала, их обрабатывают описанным способом. К веткам древесных пород присоединяют образец коры.
Растения для засушивания должны быть совершенно сухими, без следов влаги от поливки, росы или дождя, иначе растения при засушивании получатся с бурыми пятнами. Иногда растения попадают под дождь или под сильную струю воды при поливке, и тогда они получают ранение в виде обесцвеченных пятнышек на лепестках цветков и на листьях, что обнаруживается после засушивания. Такой материал совершенно негоден ни для гербария, ни для других изделий.
Цветки должны быть совершенно свежими, только что распустившимися, без увядших лепестков: соцветия сложноцветных типа астр и ромашек – с совершенно ровной бледно-желтой серединой корзинки; листья тоже должны быть без следов увядания.
При сборе растений пользуются папкой из двух листов картона размером 48х32 см, соединённых между собой тесьмой, пропущенной в разрезы (рис. 1). В эту папку помешают листы с заложенными в них растениями. В такой папке растения доставляют домой без повреждений, не увядшими.
Если растений собирается много, то их аккуратно укладывают в мешок из двусторонней клеёнки. В таком мешке растения долго не вянут и доставляются домой свежими.
3. Продолжительность засушивания
Самым главным условием сохранения природной окраски у засушенных растений является быстрейшее засушивание их на ветру, на сквозняке, на солнечном припёке, или в печке, или в сушильном шкафу с температурой от 40 до 50°С.
Увеличивать температуру в сушильном шкафу или помещать материал для засушивания в слишком горячую печь нельзя, так как это вызовет «запаривание» (побурение листьев и цветков) или же поведёт к пересушиванию растения, которое будет хрупко и ломко, а последнее обстоятельство послужит причиной его быстрого разрушения.
Засушивание растений, как правило, не должно продолжаться более трёх суток.
4. Закладка растений
Закладка растений для засушивания производится следующим образом. Лист пористой, а ещё лучше фильтровальной бумаги, размером в половину формата большой центральной газеты, перегибают пополам. Затем на одну половину помещают тонкий слой гигроскопической ваты, прикрытой марлей. Марлю кладут во избежание влипания в вату нежных лепестков цветов и ворсистых частей некоторых растений, что вызывает большие затруднения при очистке растения от ваты, а часто и повреждение его.
При закладке растения частично или целиком расправляют и располагают его части таким образом, чтобы весь его облик был наиболее близок к природе, чтобы растение выглядело свободно и натурально и, конечно, не уродливо.
Детали закладки отдельных декоративных растений будут описаны дальше.
5. Засушивание под прессом
Листы с заложенными в них растениями помещают между двумя листами фанеры. Сверху их придавливают тяжестями, например каменными или чугунными плитками или же кирпичами. Чтобы не грязнить рук об эти грузы, главным образом о кирпичи, их обертывают бумагой или обшивают какой-нибудь старой материей.
Тяжесть пресса регулируется в зависимости от мощности или нежности частей растения, учитывая, что вес каждого кирпича 4 кг. В этой же зависимости находятся и сроки пребывания листов с растениями под прессом (от 3 до 10-12 часов). В дальнейшем будет сказано, какая культура, какой тяжести требует для проведения засушивания, так как от очень сильного давления растения расплющиваются и теряют свою характерную форму.
Между листами фанеры материал для засушивания располагают так: на фанеру прежде всего помещают пачку пористой бумаги общей толщиной в 1 см, затем лист с заложенными растениями, затем снова пачку пористой бумаги общей толщиной в 1 см, затем второй лист с растениями, ещё пачку пористой или фильтровальной бумаги и, наконец, прикрывают вторым листом фанеры, на котором равномерно располагают грузы (иногда сплошь, когда требуется наибольшая тяжесть, а иногда и с промежутками).
Через каждые 2-3 часа пачки пористой бумаги, обычно отсыревшей, воспринявшей влагу от соседства с растениями, заменяют сухой бумагой, но листы с растениями оставляют нетронутыми: влага из них должна перейти во вновь заложенные прокладки из пористой бумаги.
Больше двух листов с растениями между тремя слоями пористой бумаги под пресс не помещают во избежание скопления излишней сырости между фанерными дощечками и для ускорения процесса засушивания.
С цветками и соцветиями крупными, как пеоны, мальвы, георгины, декоративные подсолнечники и др., под пресс помещают только один лист, одновременно увеличивая толщину прослоек из пористой бумаги.
Вынув из-под пресса, листы с растениями (если они ещё сыроваты, то со вновь заменёнными прокладками пористой бумаги) помещают для досушки между двумя гербарными рамками, туго перевязанными шнуром.
Можно растения сушить без предварительного помещения под пресс, прямо в гербарных рамках, что даёт наиболее яркий, эффектный материал.
6. Засушивание в гербарных рамках
Гербарная рамка состоит из куска нетолстой, но крепкой проволочной сетки, размером обычно 30х48 см, заключенной в деревянную рамку из планок шириной 3-4 см (рис. 2).
Сетка должна быть туго натянута и хорошо закреплена в дереве рамки. Материал для засушивания в листах пористой бумаги заключают между двумя такими рамками, туго связанными верёвками.
В хорошую погоду гербарные рамки с заложенным материалом помещают где-нибудь на воздухе, на солнцепёке и ветру, что и является самым лучшим способом засушивания.
В дождливую погоду или поздно вечером рамки переносят в печку или в сушильный шкаф, ставя их на ребро, или же вешают над горячей плитой.
В жаркую погоду можно помещать рамки также на чердаке под раскалённой крышей, подвешивая к протянутым верёвкам. Там, особенно при открытом слуховом окне, растения очень быстро сохнут. Гербарные рамки очень удобны в путешествии, в экскурсии.
7. Готовность засушенного материала
Готовность засушенного материала определяется так: если приподнятое с гербарного листа растение или его часть – стебель с листьями, цветок на цветоножке – держатся, сохраняя стойкость и упругость, если верхушка растения или цветка не клонится вниз, то засушивание можно считать законченным.
Пересушенное растение очень хрупко и крошится при одном прикосновении к нему. Такое растение от пересушивания теряет и природную окраску.
Не следует допускать пересушивания растений, так как такой материал не годен для использования.
Недосушенный материал, сохраняя некоторое количество влаги, быстро портится, буреет, покрывается пятнами.
Если рамки с заложенными для просушивания растениями случайно попадут под росу или дождь, то никакие мероприятия уже не спасут материал от побурения.
8. Хранение засушенного материала
Засушенные растения, особенно цветки, очень гигроскопичны и, отсырев, быстро портятся, поэтому до использования их лучше всего сохранять на тех же ватных настилах, на которых они сушились, в листах бумаги, помещаемых в коробках с крышкой или в плотно закрытых шкафах в сухом помещении, недоступном для проникновения сырости и пыли. Но нужно сказать, что излишняя сухость воздуха, близость печки или труб отопления тоже отрицательно влияют на засушенный материал. Он делается хрупким, ломким. Поэтому и та, и другая крайность одинаково вредны.
Хорошо укладывать листы с засушенными растениями в ящики или коробки соответствующего размера с откидывающимися передними стенками.
В таких же ящиках или коробках необходимо хранить и готовые гербарии, что предохранит их от вредных колебаний температуры, от сырости или излишней сухости воздуха, от пыли, а также до некоторой степени от нападения насекомых. Для борьбы с последними в хранилищах гербариев по уголкам раскладывают марлевые мешочки с камфарой, с порошком гексахлорана или ДДТ. Можно использовать и нафталин.
9. Монтирование
Монтирование означает прикрепление высушенного растения к листу плотной бумаги размером 42х30 см. На каждый лист монтируют только один виз растения. Если растение крупное, то монтируют только один экземпляр или его части корень, базальную, среднюю и верхушечную части стебля. Если же размеры растения небольшие, то на один лист монтируют несколько экземпляров одного и того же вида, собранного в одном местообитании.
Монтируют только хорошо собранные и успешно засушенные экземпляры растений. Их прикрепляют к листу тонкими полосками бумаги, клейкой лентой или пришивают нитками. В правом нижнем углу укрепляют этикетку. Без нее гербарный лист не имеет научной ценности.
Высушенное растение можно и не монтировать, а просто вложить с этикеткой в двойной лист бумаги.
Каждый гербарный лист (из лёгкого картона или толстой бумаги) должен быть такого размера, чтобы растение было показано наиболее полно и наглядно: травянистое – с корнями, стеблем, листьями, бутонами, цветками, плодами, молодыми всходами – древесные и кустарниковые – с ветками, почками, весенней и осенней листвой, цветками, семенами, кусочками коры.
Обычно размер листа учебного гербария травянистых растений равен 36х26 см, а дендрологического – 42х28 см,
На гербарных листах растения размещают таким образом, чтобы можно было видеть расположение листьев на стеблях и ветках, расположение почек, бутонов, цветков, плодов, а также оборотную сторону части листьев.
Если травянистое растение на гербарном листе можно расположить целиком, то перед засушиванием корни отряхивают, очищают от земли; листья, стебли, цветки и плоды аккуратно расправляют, чтобы не было морщинок и складок. Если нельзя избежать налегания одних листочков на другие, то между ними при сушке надо поместить по тоненькой пластинке гигроскопической ваты. Растению придают на листе положение, наиболее близкое к положению в природе. В этом положении растения засыхают, а затем из них монтируется гербарный образец.



Рис. 1.
Рис. 2.

Если же растение не поместится на гербарном листе в натуральную величину, то его разрезают, например на 2 части: верхнюю и нижнюю, засушивают, а потом 1 часть помещают в левой части гербарного листа, а другую в правой, оставляя место для этикетки.
Очень мелкие растения монтируют по нескольку экземпляров на одном листе.

Крупные сложные листья георгин, каштана, грецкого ореха можно помещать при монтировании не целиком, а половиной, ввиду симметричности сторон, при аккуратном разрезе вдоль.
На каждом гербарном листе располагают целиком или частями один какой-либо вид или сорт растения, например: дуб красный, берёза бородавчатая, клён татарский, мак восточный, незабудка, виола, пшеница озимая, рожь и т. д.
Растения закрепляют на гербарном листе узкими полосками бумаги или незаметными стежками ниток. При изготовлении художественных композиций все зелёные части растения подшивают нитками зеленоватого (защитного) цвета; красные, жёлтые, голубые цветки – нитками соответствующего оттенка.
Иголку с ниткой пропускают с обратной стороны гербарного листа на лицевую, перекидывают через стебель и пропускают опять на обратную сторону маленьким стежком. Прикрепив растение в одной точке к листу гербария, таким же образом «перехватывают», прикрепляют ещё в нескольких точках стебли, листья, цветки, плоды, стараясь обходиться

Рис. 6. Лист гербария со злаком, разрезанным пополам.


минимальным количеством незаметных стежков.
В правом нижнем углу каждого гербарного листа надо оставить свободное место для наклейки этикетки.
10. Определение
Заложив растения в пресс для сушки, приступают к их определению. Для этого берут вторые экземпляры растений, поставленные в воду.
На основании определения и черновой этикетки заполняют чернилами или тушью постоянную этикетку, которая является, научным документом. В этой последней этикетке указывают учреждение, которому принадлежит гербарий, семейство и вид растения на латинском и русском языках, место сбора, место обитание, степень распространения, дату сбора, фамилию собравшего и определившего растение.
Гербарная этикетка – это научный документ. Без этикетки гербарный образец не может иметь никакого научного и учебного значения.

Общепринятый размер этикетки – 12х7 см (1/3 полулиста обыкновенной писчей бумаги).
Образец этикетки см. на предыдущей странице.
Для защиты нашитых на гербарные листы растений от порчи, при соприкосновении с растениями смежных гербарных листов, а также от пыли, употребляются обычно листы

Рис. 7. Предохранение гербарных листов от порчи.


Оформление этикетки:
Сем. Лютиковые – Ranunculaceae
Калужница болотная - Caltha palustris L.
Омская область, Тарский р-н, окр. с Атак.
Заболоченный луг
14.06.2001 г.
Н.Н. Иванов

обёрточной бумаги с запахивающимися двусторонними клапанами. Можно также делать из папиросной или другой тонкой бумаги покрывные листы, которые приклеиваются к верхнему краю каждого гербарного листа с обратной его стороны (рис. 7).
Настенные гербарии познавательного характера (как наглядное пособие в классах и лекционных залах) заключают под стекло и окантовывают тёмной бумагой или узкими полосками технического коленкора.
Зерновые культуры с колосьями, полными зёрен, лучше всего помещать под стекло, с окантовкой, для предохранения от осыпания.
11. Инсерирование гербария
Инсерация – это складывание растений в определенном порядке: сначала по семействам, в рамках одного семейства – по родам, в рамках родов – по видам. Роды и виды удобно располагать в алфавитном порядке. Семейства лучше размещать по одной из классификационных систем.










13 PAGE \* MERGEFORMAT 144615


Рис. 4. Рисовальный аппарат РА-4: 1 - откидная оправа с призмой-кубиком; 2 - сектор со светофильтрами; 3 - хомутик; 4 - штанга; 5 - зеркало





Рисунок 1Рисунок 7Рисунок 10Рисунок 16ґђ Заголовок 1ґђ Заголовок 3ґђ Заголовок 615

Приложенные файлы

  • doc 14818835
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий